硒(Selenium,Se)是一種必需微量元素,在保持機(jī)體健康和維持體內(nèi)平衡中發(fā)揮作用。硒缺乏時(shí)影響細(xì)胞增殖,氧化應(yīng)激以及細(xì)胞存活,并可導(dǎo)致多種器官損傷,如腦、靜脈、肌肉、腸和肝組織的損傷。許多研究表明日糧硒缺乏可誘導(dǎo)機(jī)體肝細(xì)胞凋亡。肝臟是人體吸收營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的主要器官,是硒缺乏反應(yīng)的主要靶標(biāo)之一。肝細(xì)胞凋亡是肝組織硒缺乏的特征性病理變化。microRNA(miRNA)作為一段非編碼RNA,可以通過(guò)靶向性介導(dǎo)目的基因轉(zhuǎn)錄使目的基因沉默,進(jìn)而調(diào)控蛋白表達(dá)來(lái)操控體內(nèi)不同的生物反應(yīng),它在細(xì)胞增殖、分化、凋亡和腫瘤發(fā)生發(fā)展中起重要作用。研究表明多種miRNA通過(guò)影響細(xì)胞凋亡因子,參與到凋亡的發(fā)生和發(fā)展的調(diào)控中。miRNA在肝臟疾病中也發(fā)揮巨大作用。近年來(lái),研究表明機(jī)體硒含量的降低可改變相關(guān)器官內(nèi)miRNA的表達(dá)。然而,關(guān)于硒缺乏期間細(xì)胞凋亡的發(fā)生具體機(jī)制以及miRNA如何調(diào)控肉雞肝細(xì)胞凋亡的研究尚未完善。本研究的目的是研究miRNA誘導(dǎo)缺硒肝細(xì)胞凋亡的發(fā)生機(jī)理。為闡明硒缺乏對(duì)肝細(xì)胞凋亡過(guò)程中特異性miRNA及其靶蛋白的作用機(jī)制,本研究復(fù)制了硒缺乏肉雞模型,通過(guò)實(shí)驗(yàn)室組學(xué)研究以及實(shí)時(shí)定量PCR(qRT-PCR)方法篩選出特異性強(qiáng)的miRNA,miR-193b-3p。結(jié)合生物信息學(xué)預(yù)測(cè),雙熒光素酶報(bào)告基因檢測(cè)系統(tǒng)和qRT-PCR方法分析并篩選出硒缺乏型肉雞肝臟凋亡的特異性靶蛋白MAML1。本研究通過(guò)超微結(jié)構(gòu)觀察、qRT-PCR、蛋白印跡(WB)以及流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)等方法檢測(cè)硒缺乏型肉雞肝臟和miR-193b-3p轉(zhuǎn)染的原代肝細(xì)胞的凋亡。試驗(yàn)結(jié)果如下:(1)成功復(fù)制缺硒性肉雞模型基礎(chǔ)上,觀察缺硒肉雞肝細(xì)胞變化,超微結(jié)構(gòu)觀察顯示肝細(xì)胞核濃縮,核仁變小,核質(zhì)成塊狀凝聚于核膜周邊,線粒體產(chǎn)生空泡,有些線粒體破裂,線粒體嵴消失等多種凋亡特征,說(shuō)明缺硒引起肉雞肝細(xì)胞凋亡。(2)篩選出miR-193b-3p是硒缺乏特異性miRNA,在缺硒肉雞肝臟中呈顯著高表達(dá)。在建立雞原代培養(yǎng)肝臟細(xì)胞模型基礎(chǔ)上,成功構(gòu)建了miR-193b-3p過(guò)表達(dá)和敲低模型。預(yù)測(cè)并成功驗(yàn)證了miR-193b-3p與其靶基因MAML1的關(guān)系。miR-193b-3p與MAML1的表達(dá)呈負(fù)相關(guān)。(3)在建立雞原代培養(yǎng)肝臟細(xì)胞miR-193b-3p過(guò)表達(dá)/抑制模型的基礎(chǔ)上,用STAT1抑制劑Fludarabine(Flu)處理miR-193b-3p過(guò)表達(dá)的肝細(xì)胞。結(jié)果顯示肝臟細(xì)胞過(guò)表達(dá)miR-193b-3p時(shí),細(xì)胞早期凋亡,晚期凋亡比率與對(duì)照組相比明顯上升。而敲低miR-193b-3p后,細(xì)胞凋亡率與對(duì)照組相比明顯下降,加入Flu后,細(xì)胞凋亡率仍然比對(duì)照組低。(4)通過(guò)對(duì)缺硒誘導(dǎo)的凋亡分子機(jī)制的研究發(fā)現(xiàn),miR-193b-3p過(guò)表達(dá)誘導(dǎo)的凋亡可能是通過(guò)線粒體途徑產(chǎn)生。qRT-PCR和WB方法檢測(cè)凋亡通路中關(guān)鍵基因的表達(dá),結(jié)果顯示,miR-193b-3p過(guò)表達(dá)增加了IFNγ、STAT1、IRF1、Bak、Bax、Cyt-c、Caspase9和Caspase3的釋放,并抑制了MAML1和Bcl_2的釋放。(5)硒缺乏肉雞肝臟組織中miR-193b-3p表達(dá)上調(diào)而MAML1表達(dá)下調(diào),為進(jìn)一步驗(yàn)證肝細(xì)胞凋亡調(diào)控機(jī)制,本試驗(yàn)檢測(cè)了硒缺乏肉雞肝臟中凋亡相關(guān)基因的表達(dá)。結(jié)果與體外培養(yǎng)原代肝細(xì)胞轉(zhuǎn)染miR-193b-3p一致,表明miR-193b-3p和其靶基因MAML1參與了低硒引起的肝臟線粒體通路的凋亡�？傊�,結(jié)果表明硒缺乏可以通過(guò)調(diào)控miR-193b-3p的表達(dá),介導(dǎo)其靶蛋白MAML1參與線粒體途徑的肉雞肝細(xì)胞凋亡。這為硒缺乏導(dǎo)致的肝細(xì)胞損傷機(jī)制的研究提供了新的思路。
【學(xué)位單位】：東北農(nóng)業(yè)大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位年份】：2018
【中圖分類(lèi)】：S858.31
【部分圖文】：

和硒缺乏組的肉雞沒(méi)有出現(xiàn)死亡現(xiàn)象。對(duì)照組的肉雞飲水和飼喂正長(zhǎng)良好，排泄物正常。 缺硒組肉雞雞出現(xiàn)一些異�，F(xiàn)象，如運(yùn)動(dòng)，胸部和翼部區(qū)域出現(xiàn)青色或褐色斑點(diǎn)。尸檢結(jié)果顯示，硒缺乏組典型的缺硒性滲出性素質(zhì)（ED）。在缺硒組實(shí)驗(yàn)的第 20 天，90 只因此，我們證實(shí)了由缺硒飲食引起的缺硒肉雞模型成功復(fù)制。在硒缺乏組肝臟中的活性低于對(duì)照組（表 3-1）。為了研究硒缺乏對(duì)研究通過(guò)透射電子顯微鏡觀察了硒缺乏肉雞肝臟組織的超微結(jié)構(gòu)變。對(duì)照組肉雞肝細(xì)胞顯示正常的結(jié)構(gòu)；而在硒缺乏組觀察到肝細(xì)胞征，細(xì)胞核濃縮、核仁變小、線粒體產(chǎn)生空泡，有些線粒體出現(xiàn)破種特征。這些結(jié)果均表明，硒缺乏可導(dǎo)致肝細(xì)胞凋亡。肉雞硒缺乏表 3-1 對(duì)照組及硒缺乏組硒含量Tab. 3-1 Se status in C group and Se deficiency groupC group Se deficiency grouPx in liver（U/mg.pr） 941.68±24.69 427.44±32.46 *** liver（μg/mg） 5.769±0.026 1.487±0.017 ***

硒缺乏介導(dǎo) miR-193b-3p 調(diào)控特異性靶標(biāo) MAML1 硒缺乏對(duì)肉雞肝臟 miR-193b-3p 表達(dá)的影響據(jù)實(shí)驗(yàn)室高通量測(cè)序結(jié)果以及 qRT-PCR 方法對(duì)相關(guān) miRNA 的檢測(cè)顯示，mp 是肝組織硒缺乏的特異性 miRNA 之一。正常肝組織和缺硒肝組織中 miR-193b含量如圖 3-2 所示。結(jié)果顯示，miR-193b-3p 在缺硒肝組織（L 組）的表達(dá)水平組織（C 組）顯著上調(diào)，高于正常組 7 倍，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）�？桑琺iR-193b-3p 的表達(dá)增加。結(jié)合電鏡觀察結(jié)果，miR-193b-3p 作為硒缺乏肝組 miRNA 可能與硒缺乏誘導(dǎo)的肝細(xì)胞凋亡有關(guān)。

（I-100、I-150 和 I-200）降低，miR-193b-3p inhibitor 終濃度在 100 n于對(duì)照組，下降了 60%以上（P<0.05）。因此，本研究中使用的 miRN的，肝臟細(xì)胞 miR-193b-3p 的過(guò)表達(dá)/抑制體外模型建立成功，可用于，過(guò)表達(dá)組轉(zhuǎn)染 miR-193b-3p mimic 的終濃度為 100 nM；抑制組轉(zhuǎn)ibitor 的終濃度為 100 nM 時(shí)可達(dá)到最佳轉(zhuǎn)染效果。

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本文編號(hào)：2813327