奶牛乳腺炎是奶牛場(chǎng)最常見(jiàn)疾病之一,嚴(yán)重影響著奶牛場(chǎng)的經(jīng)濟(jì)效益。為培育乳腺炎抗病性強(qiáng)的奶牛品種,乳腺炎相關(guān)基因挖掘及分子調(diào)控機(jī)制研究顯得尤為重要。乳腺炎奶牛的基因表達(dá)譜受病原菌的類(lèi)型、感染劑量、感染時(shí)間等因素的影響比較大。迄今為止,奶牛乳腺炎的分子機(jī)制尚未完全清楚。因此,為深入、系統(tǒng)地挖掘乳腺炎相關(guān)基因,探討奶牛乳腺炎的分子機(jī)制,本研究分別利用E.coli或S.aureus,采用與文獻(xiàn)報(bào)道不同的感染劑量(5mL 1×10~5 CFU/mL)和感染時(shí)間(7d),成功構(gòu)建了E.coli型和S.aureus型的實(shí)驗(yàn)性乳腺炎模型,在此基礎(chǔ)上,分別進(jìn)行了乳腺組織和誘導(dǎo)不同時(shí)間外周血的轉(zhuǎn)錄組、miRNA組測(cè)序和差異表達(dá)mRNA、miRNA篩選,并進(jìn)行了乳腺組織mRNA-miRNA聯(lián)合分析。此外,采用miRNA超表達(dá)/沉默、qPCR、Western Blotting、ELISA、流式細(xì)胞等技術(shù),進(jìn)行了差異表達(dá)bta-miR-146a在LPS誘導(dǎo)的乳腺上皮細(xì)胞(bMEC)炎癥反應(yīng)中的分子機(jī)制研究,獲得了如下主要結(jié)果:(1)E.coli和S.aureus感染的兩種類(lèi)型乳腺炎奶牛乳腺組織中TLR4/NF-κB信號(hào)通路關(guān)鍵分子TLR4、IRAK1、TRAF6、NF-κB和TNFα的表達(dá)量均顯著升高(P0.01),說(shuō)明該模型啟動(dòng)了固有免疫應(yīng)答和炎癥反應(yīng)。(2)獲得了E.coli型和S.aureus型乳腺炎乳腺組織的mRNA和miRNA表達(dá)譜,以及差異表達(dá)mRNA(DIE-mRNA)和差異表達(dá)miRNA(DIE-miRNA)。與對(duì)照組相比,E.coli誘導(dǎo)組乳腺組織中有2388個(gè)DIE-mRNA和305個(gè)DIE-miRNA;S.aureus誘導(dǎo)組乳腺組織中有2642個(gè)DIE-mRNA和279個(gè)DIE-miRNA。其中,LOC785756、AQP5、bta-miR-202和bta-miR-2357可能為E.coli型乳腺炎乳腺組織的分子標(biāo)志物;DDC、C1QTNF3、CCDC60、TCTEX1D1、ZNF358、FNDC1、COL11A1和bta-miR-2335可能為S.aureus型乳腺炎乳腺組織的分子標(biāo)志物。(3)E.coli型和S.aureus型乳腺炎乳腺組織的基因表達(dá)譜差異很大。與S.aureus誘導(dǎo)組相比,有627個(gè)DIE-mRNA和21個(gè)DIE-miRNA在E.coli誘導(dǎo)組乳腺組織中表達(dá)顯著下調(diào)(P0.001);482個(gè)DIE-mRNA和70個(gè)DIE-miRNA在E.coli誘導(dǎo)組乳腺組織中表達(dá)顯著上調(diào)(P0.001),推測(cè)這些DIE-mRNA和DIE-miRNA在兩種類(lèi)型乳腺炎癥反應(yīng)過(guò)程中的作用可能存在差異,也可能與炎癥程度和免疫應(yīng)答過(guò)程不同步有關(guān)。(4)獲得了乳腺炎乳腺組織在免疫調(diào)節(jié)和細(xì)胞凋亡方面的miRNA-mRNA調(diào)控網(wǎng)絡(luò)。在免疫調(diào)節(jié)方面,miRNA主要調(diào)節(jié)TLRs信號(hào)通路、CD家族、細(xì)胞因子或細(xì)胞因子受體相關(guān)的mRNA。在細(xì)胞凋亡方面,兩種類(lèi)型乳腺炎存在共同調(diào)控的4個(gè)mRNA(BAX、BCL2A1、BCL2L14和PYCARD)和5個(gè)miRNA(bta-miR-1486、bta-miR-885、bta-miR-30e-5p、bta-miR-139和bta-miR-1291)。(5)獲得了E.coli型和S.aureus型乳腺炎奶牛不同誘導(dǎo)時(shí)間外周血的基因表達(dá)譜和差異表達(dá)基因。其中,6個(gè)已知基因(ZBTB39、AMER1、KLHL9、ABHD13、FZD5和TET2)和3個(gè)新基因(Cow_newGene_1702、Cow_newGene_4598和Cow_newGene_4025)可能為E.coli型乳腺炎的血液分子標(biāo)志物;HBM、HBG、DEFB5、CCR3、bta-miR-1301和bta-miR-2284r可能為S.aureus型乳腺炎的血液分子標(biāo)志物。(6)獲得了E.coli型和S.aureus型乳腺炎乳腺組織和外周血的DIE-miRNA和DIE-mRNA的功能注釋。結(jié)果表明所獲得的DIE-miRNA和DIE-mRNA與遺傳信息處理、生物系統(tǒng)、疾病、代謝、細(xì)胞過(guò)程和環(huán)境信息處理6個(gè)方面有關(guān),并共同參與了包括TLRs信號(hào)通路、趨化因子信號(hào)通路、細(xì)胞因子與細(xì)胞因子受體作用信號(hào)通路、白細(xì)胞跨內(nèi)皮遷移等在內(nèi)的多個(gè)關(guān)鍵免疫信號(hào)通路,進(jìn)而調(diào)節(jié)奶牛乳腺炎的發(fā)展過(guò)程。(7)TLR4和TRAF6為bta-miR-146a的靶基因。在LPS誘導(dǎo)bMEC炎癥反應(yīng)的過(guò)程中,bta-miR-146a可靶向抑制TRAF6基因的mRNA和蛋白質(zhì)表達(dá);對(duì)于TLR4基因而言,在細(xì)胞炎癥反應(yīng)前期,bta-miR-146a可顯著抑制TLR4基因的表達(dá)(P0.05),而在炎癥反應(yīng)后期,bta-miR-146a的抑制效應(yīng)差異不顯著(P0.05),表明在炎癥反應(yīng)后期可能有其他因子共同調(diào)節(jié)著TLR4基因的表達(dá)。(8)LPS可激活bMEC內(nèi)TLR4/NF-κB信號(hào)通路,使得TLR4、TRAF6和轉(zhuǎn)錄因子NF-κB的表達(dá)量升高,從而促使bta-miR-146a的表達(dá)量升高,而高表達(dá)的bta-miR-146a負(fù)反饋抑制靶基因TLR4和TRAF6的表達(dá),進(jìn)而抑制了NF-κB的表達(dá)和炎癥因子IL-6、IL-8和TNF-α的分泌,緩解了bMEC的炎癥反應(yīng)過(guò)程。(9)bta-miR-146a促進(jìn)了炎癥反應(yīng)過(guò)程中bMEC的凋亡。上述研究為闡明奶牛乳腺炎的分子機(jī)制奠定了基礎(chǔ),為乳腺炎的基因診斷、基因治療和抗病分子育種提供了新思路,具有潛在的應(yīng)用價(jià)值。
【學(xué)位單位】：西北農(nóng)林科技大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位年份】：2018
【中圖分類(lèi)】：S858.23
【部分圖文】：

則由 TIR（Toll/IL-1 receptor）結(jié)構(gòu)域構(gòu)成(Akira et al. 2006; Kum)。TLRs 蛋白的 LRR 結(jié)構(gòu)域可以識(shí)別宿主細(xì)胞外的 PAMPs，），而胞內(nèi)的 TIR 結(jié)構(gòu)域可與 MyD88 的 C 端 TIR 結(jié)構(gòu)域結(jié)MyD88 再通過(guò) N 端的 DD 結(jié)構(gòu)域與下游信號(hào)分子 IL-1R 相關(guān)RAKs 磷酸化后可活化 TRAF6，激活 JNK 和 NF-κB 信號(hào)通路 和 NF-κB 的表達(dá)，從而使炎癥因子、黏附分子等多種炎癥相引起宿主細(xì)胞固有免疫反應(yīng)（圖 1-1）(Akira et al. 2001; WerlingLRs 研究進(jìn)展和小鼠 TLRs 在免疫系統(tǒng)中的作用機(jī)制研究的深入開(kāi)展，牛開(kāi)。迄今為止，發(fā)現(xiàn)牛 TLRs 家族至少有 10 個(gè)成員，其中定位在 BTA6 上，TLR7 和 TLR 定位在 X 染色體上，TLR2、LR9 分別定位在 BTA17、BTA27、BTA8、BTA16 和 BTA22 上(Mc. 2003)。qPCR 研究結(jié)果顯示，TLR1~10 在牛機(jī)體防御有關(guān)的zies and Ingham 2006)。

表明乳腺炎模型已成功建立。2.3.2 乳腺組織病理鑒定為了確認(rèn)臨床檢查結(jié)果，本研究通過(guò)乳腺組織切片的 H＆E 染色和病理觀察，來(lái)驗(yàn)證乳腺炎的病理情況，結(jié)果如圖 2-1 所示。結(jié)果表明，與對(duì)照組（圖 2-1A）相比，E.coli感染組（圖 2-1B）和 S.aureus 感染組（圖 2-1C）產(chǎn)生了明顯的病理變化，如：乳腺小葉結(jié)構(gòu)破壞，有些乳腺上皮細(xì)胞產(chǎn)生分離，腺泡腔減小，乳腺腺泡受損，并出現(xiàn)炎性細(xì)胞（包括中性粒細(xì)胞和巨噬細(xì)胞）浸潤(rùn)等。上述結(jié)果表明，我們成功誘導(dǎo)了奶牛乳腺炎，可用于后續(xù)的高通量測(cè)序和基因/蛋白質(zhì)表達(dá)量檢測(cè)。A B C

并進(jìn)行了比較分析，結(jié)果如圖2-2、圖 2-3、圖 2-4、圖 2-5 和圖 2-6 所示。結(jié)果表明，與對(duì)照組相比，S.aureus 誘導(dǎo)組和 E.coli 誘導(dǎo)組的 TLR4、IRAK1、TRAF6、NF-κB 和 TNFα 蛋白質(zhì)的表達(dá)量顯著上升（P<0.01），表明 S.aureus 和 E.coli 分別使得奶牛乳腺組織啟動(dòng)了 TLR4/NF-κB 信號(hào)通路介導(dǎo)的固有免疫和炎癥反應(yīng)過(guò)程。此外，S.aureus 誘導(dǎo)組乳腺組織中 TLR4、IRAK1 和TRAF6 蛋白質(zhì)的表達(dá)量顯著高于 E.coli 誘導(dǎo)組（P<0.01），而兩個(gè)實(shí)驗(yàn)組間 NF-κB 和 TNFα的表達(dá)量差異均不顯著（P>0.05），表明 S.aureus 對(duì) TLR4/NF-κB 信號(hào)通路上游基因表達(dá)量的影響較大。為了驗(yàn)證免疫熒光的可靠性，我們對(duì)信號(hào)通路關(guān)鍵的 TLR4、TRAF6 和 NF-κB 蛋白質(zhì)進(jìn)行了 Wertern Blotting 檢測(cè)，并以 β-actin 為內(nèi)參

【參考文獻(xiàn)】

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本文編號(hào)：2812984