奶牛乳腺炎是奶牛場最常見疾病之一,嚴重影響著奶牛場的經(jīng)濟效益。為培育乳腺炎抗病性強的奶牛品種,乳腺炎相關基因挖掘及分子調(diào)控機制研究顯得尤為重要。乳腺炎奶牛的基因表達譜受病原菌的類型、感染劑量、感染時間等因素的影響比較大。迄今為止,奶牛乳腺炎的分子機制尚未完全清楚。因此,為深入、系統(tǒng)地挖掘乳腺炎相關基因,探討奶牛乳腺炎的分子機制,本研究分別利用E.coli或S.aureus,采用與文獻報道不同的感染劑量(5mL 1×10~5 CFU/mL)和感染時間(7d),成功構建了E.coli型和S.aureus型的實驗性乳腺炎模型,在此基礎上,分別進行了乳腺組織和誘導不同時間外周血的轉(zhuǎn)錄組、miRNA組測序和差異表達mRNA、miRNA篩選,并進行了乳腺組織mRNA-miRNA聯(lián)合分析。此外,采用miRNA超表達/沉默、qPCR、Western Blotting、ELISA、流式細胞等技術,進行了差異表達bta-miR-146a在LPS誘導的乳腺上皮細胞(bMEC)炎癥反應中的分子機制研究,獲得了如下主要結(jié)果:(1)E.coli和S.aureus感染的兩種類型乳腺炎奶牛乳腺組織中TLR4/NF-κB信號通路關鍵分子TLR4、IRAK1、TRAF6、NF-κB和TNFα的表達量均顯著升高(P0.01),說明該模型啟動了固有免疫應答和炎癥反應。(2)獲得了E.coli型和S.aureus型乳腺炎乳腺組織的mRNA和miRNA表達譜,以及差異表達mRNA(DIE-mRNA)和差異表達miRNA(DIE-miRNA)。與對照組相比,E.coli誘導組乳腺組織中有2388個DIE-mRNA和305個DIE-miRNA;S.aureus誘導組乳腺組織中有2642個DIE-mRNA和279個DIE-miRNA。其中,LOC785756、AQP5、bta-miR-202和bta-miR-2357可能為E.coli型乳腺炎乳腺組織的分子標志物;DDC、C1QTNF3、CCDC60、TCTEX1D1、ZNF358、FNDC1、COL11A1和bta-miR-2335可能為S.aureus型乳腺炎乳腺組織的分子標志物。(3)E.coli型和S.aureus型乳腺炎乳腺組織的基因表達譜差異很大。與S.aureus誘導組相比,有627個DIE-mRNA和21個DIE-miRNA在E.coli誘導組乳腺組織中表達顯著下調(diào)(P0.001);482個DIE-mRNA和70個DIE-miRNA在E.coli誘導組乳腺組織中表達顯著上調(diào)(P0.001),推測這些DIE-mRNA和DIE-miRNA在兩種類型乳腺炎癥反應過程中的作用可能存在差異,也可能與炎癥程度和免疫應答過程不同步有關。(4)獲得了乳腺炎乳腺組織在免疫調(diào)節(jié)和細胞凋亡方面的miRNA-mRNA調(diào)控網(wǎng)絡。在免疫調(diào)節(jié)方面,miRNA主要調(diào)節(jié)TLRs信號通路、CD家族、細胞因子或細胞因子受體相關的mRNA。在細胞凋亡方面,兩種類型乳腺炎存在共同調(diào)控的4個mRNA(BAX、BCL2A1、BCL2L14和PYCARD)和5個miRNA(bta-miR-1486、bta-miR-885、bta-miR-30e-5p、bta-miR-139和bta-miR-1291)。(5)獲得了E.coli型和S.aureus型乳腺炎奶牛不同誘導時間外周血的基因表達譜和差異表達基因。其中,6個已知基因(ZBTB39、AMER1、KLHL9、ABHD13、FZD5和TET2)和3個新基因(Cow_newGene_1702、Cow_newGene_4598和Cow_newGene_4025)可能為E.coli型乳腺炎的血液分子標志物;HBM、HBG、DEFB5、CCR3、bta-miR-1301和bta-miR-2284r可能為S.aureus型乳腺炎的血液分子標志物。(6)獲得了E.coli型和S.aureus型乳腺炎乳腺組織和外周血的DIE-miRNA和DIE-mRNA的功能注釋。結(jié)果表明所獲得的DIE-miRNA和DIE-mRNA與遺傳信息處理、生物系統(tǒng)、疾病、代謝、細胞過程和環(huán)境信息處理6個方面有關,并共同參與了包括TLRs信號通路、趨化因子信號通路、細胞因子與細胞因子受體作用信號通路、白細胞跨內(nèi)皮遷移等在內(nèi)的多個關鍵免疫信號通路,進而調(diào)節(jié)奶牛乳腺炎的發(fā)展過程。(7)TLR4和TRAF6為bta-miR-146a的靶基因。在LPS誘導bMEC炎癥反應的過程中,bta-miR-146a可靶向抑制TRAF6基因的mRNA和蛋白質(zhì)表達;對于TLR4基因而言,在細胞炎癥反應前期,bta-miR-146a可顯著抑制TLR4基因的表達(P0.05),而在炎癥反應后期,bta-miR-146a的抑制效應差異不顯著(P0.05),表明在炎癥反應后期可能有其他因子共同調(diào)節(jié)著TLR4基因的表達。(8)LPS可激活bMEC內(nèi)TLR4/NF-κB信號通路,使得TLR4、TRAF6和轉(zhuǎn)錄因子NF-κB的表達量升高,從而促使bta-miR-146a的表達量升高,而高表達的bta-miR-146a負反饋抑制靶基因TLR4和TRAF6的表達,進而抑制了NF-κB的表達和炎癥因子IL-6、IL-8和TNF-α的分泌,緩解了bMEC的炎癥反應過程。(9)bta-miR-146a促進了炎癥反應過程中bMEC的凋亡。上述研究為闡明奶牛乳腺炎的分子機制奠定了基礎,為乳腺炎的基因診斷、基因治療和抗病分子育種提供了新思路,具有潛在的應用價值。
【學位單位】：西北農(nóng)林科技大學
【學位級別】：博士
【學位年份】：2018
【中圖分類】：S858.23
【部分圖文】：

則由 TIR（Toll/IL-1 receptor）結(jié)構域構成(Akira et al. 2006; Kum)。TLRs 蛋白的 LRR 結(jié)構域可以識別宿主細胞外的 PAMPs，），而胞內(nèi)的 TIR 結(jié)構域可與 MyD88 的 C 端 TIR 結(jié)構域結(jié)MyD88 再通過 N 端的 DD 結(jié)構域與下游信號分子 IL-1R 相關RAKs 磷酸化后可活化 TRAF6，激活 JNK 和 NF-κB 信號通路 和 NF-κB 的表達，從而使炎癥因子、黏附分子等多種炎癥相引起宿主細胞固有免疫反應（圖 1-1）(Akira et al. 2001; WerlingLRs 研究進展和小鼠 TLRs 在免疫系統(tǒng)中的作用機制研究的深入開展，牛開。迄今為止，發(fā)現(xiàn)牛 TLRs 家族至少有 10 個成員，其中定位在 BTA6 上，TLR7 和 TLR 定位在 X 染色體上，TLR2、LR9 分別定位在 BTA17、BTA27、BTA8、BTA16 和 BTA22 上(Mc. 2003)。qPCR 研究結(jié)果顯示，TLR1~10 在牛機體防御有關的zies and Ingham 2006)。

表明乳腺炎模型已成功建立。2.3.2 乳腺組織病理鑒定為了確認臨床檢查結(jié)果，本研究通過乳腺組織切片的 H＆E 染色和病理觀察，來驗證乳腺炎的病理情況，結(jié)果如圖 2-1 所示。結(jié)果表明，與對照組（圖 2-1A）相比，E.coli感染組（圖 2-1B）和 S.aureus 感染組（圖 2-1C）產(chǎn)生了明顯的病理變化，如：乳腺小葉結(jié)構破壞，有些乳腺上皮細胞產(chǎn)生分離，腺泡腔減小，乳腺腺泡受損，并出現(xiàn)炎性細胞（包括中性粒細胞和巨噬細胞）浸潤等。上述結(jié)果表明，我們成功誘導了奶牛乳腺炎，可用于后續(xù)的高通量測序和基因/蛋白質(zhì)表達量檢測。A B C

并進行了比較分析，結(jié)果如圖2-2、圖 2-3、圖 2-4、圖 2-5 和圖 2-6 所示。結(jié)果表明，與對照組相比，S.aureus 誘導組和 E.coli 誘導組的 TLR4、IRAK1、TRAF6、NF-κB 和 TNFα 蛋白質(zhì)的表達量顯著上升（P<0.01），表明 S.aureus 和 E.coli 分別使得奶牛乳腺組織啟動了 TLR4/NF-κB 信號通路介導的固有免疫和炎癥反應過程。此外，S.aureus 誘導組乳腺組織中 TLR4、IRAK1 和TRAF6 蛋白質(zhì)的表達量顯著高于 E.coli 誘導組（P<0.01），而兩個實驗組間 NF-κB 和 TNFα的表達量差異均不顯著（P>0.05），表明 S.aureus 對 TLR4/NF-κB 信號通路上游基因表達量的影響較大。為了驗證免疫熒光的可靠性，我們對信號通路關鍵的 TLR4、TRAF6 和 NF-κB 蛋白質(zhì)進行了 Wertern Blotting 檢測，并以 β-actin 為內(nèi)參

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本文編號：2812984