伴隨著我國奶牛養(yǎng)殖產(chǎn)業(yè)近幾年來的飛速發(fā)展,目前初步達成了集約化的畜牧產(chǎn)業(yè)模式,但制約畜牧業(yè)發(fā)展的動物疾病也隨之而來。亞急性瘤胃酸中毒(subacute rumen acidosis,SARA)是奶牛生產(chǎn)實踐中常見的群發(fā)性營養(yǎng)代謝病,瘤胃液pH每天介于5.0~5.5之間的時間持續(xù)3小時以上則可定義為SARA。SARA發(fā)生原因是由于奶牛瘤胃內(nèi)容物發(fā)酵產(chǎn)生的乙酸、丙酸、丁酸等短鏈脂肪酸(short-chain fatty acid,SCFA)和脂多糖(lipopolysaccharide,LPS)的含量增加,且在瘤胃內(nèi)的吸收發(fā)生障礙,在瘤胃內(nèi)大量積累。在瘤胃上皮細胞中鈉離子耦合單羧酸轉(zhuǎn)運蛋白1(SLC5A8)和氫離子耦合單羧酸轉(zhuǎn)運蛋白1(MCT1)對SCFA的轉(zhuǎn)運起重要作用,發(fā)生SARA的時候,瘤胃長時間處于低pH環(huán)境下,使其中的革蘭氏陰性菌裂解死亡,釋放出大量LPS。之前有研究表明高濃度的LPS可以損傷瘤胃上皮組織,并且在很多組織內(nèi)可以引起自噬的發(fā)生。自噬是一個高度動態(tài)的生理過程,主要作用是分解細胞中衰老及破損的蛋白質(zhì)大分子及細胞器,并產(chǎn)生氨基酸、脂肪酸等基礎(chǔ)營養(yǎng)物質(zhì)供給細胞,在生命活動中起到重要的作用。而高濃度的LPS使自噬被過度激活,結(jié)果大量的自噬體無法及時清除,導(dǎo)致異常積聚,但是LPS對瘤胃上皮細胞自噬的具體影響還沒有確定。本試驗采用體外實驗和體內(nèi)實驗研究LPS對瘤胃上皮細胞自噬和轉(zhuǎn)運蛋白SLC5A8和MCT1的影響。在體內(nèi)實驗中應(yīng)用Western blot檢測健康及SARA奶牛瘤胃上皮自噬關(guān)鍵蛋白雷帕霉素靶蛋白(mammalian target of rapamycin,mTOR)通路中關(guān)鍵蛋白磷酸化mTOR(pmTOR)、mTOR、微管相關(guān)蛋白1輕鏈3(LC3)和自噬降解底物(p62)蛋白表達的變化,以及MCT1、SLC5A8轉(zhuǎn)運蛋白表達量的變化。結(jié)果顯示mTOR和LC3蛋白表達量增多,pmTOR和p62蛋白表達量減少;通過透射電鏡觀察瘤胃上皮組織細胞內(nèi)自噬泡形成,結(jié)果顯示自噬泡增多。為進一步研究LPS對瘤胃上皮細胞自噬和轉(zhuǎn)運蛋白SLC5A8和MCT1的影響,應(yīng)用體外培養(yǎng)的瘤胃上皮細胞方式進行實驗。將體外培養(yǎng)的細胞用LPS和組胺分別進行不同時間點的刺激,刺激時間點為0、1、3、6、9、18 h,結(jié)果表明LPS和組胺刺激瘤胃上皮細胞的最佳時間點為6h。進行不同LPS濃度梯度刺激(0,1,5,10μg/ml)和不同濃度組胺(0,20,40,60μM),Western blot檢測LPS和組胺刺激的p-mTOR、mTOR、LC3、p62蛋白表達量的變化。結(jié)果顯示LPS刺激的mTOR和LC3蛋白表達量上升,p-mTOR和p62蛋白表達量下降;組胺刺激的mTOR和LC3蛋白表達量下降,p-mTOR和p62蛋白表達量上升。為了驗證高濃度LPS是否通過促進自噬來抑制轉(zhuǎn)運蛋白MCT1、SLC5A8,將瘤胃上皮細胞分為空白對照組、LPS組、LPS+自噬的抑制劑(CQ、3-MA)組。Western blot檢測LC3、p62蛋白表達變化和MCT1、SLC5A8轉(zhuǎn)運蛋白表達變化,結(jié)果顯示用高濃度LPS刺激轉(zhuǎn)運蛋白MCT1、SLC5A8會被抑制,而當(dāng)自噬被抑制的時候轉(zhuǎn)運蛋白MCT1、SLC5A8會被激活。免疫熒光觀察MCT1、LC3蛋白表達量的變化情況,結(jié)果顯示當(dāng)瘤胃上皮細胞處于高濃度LPS刺激會促進自噬的發(fā)生也會抑制轉(zhuǎn)運蛋白MCT1的表達。綜上所述,高濃度LPS會使瘤胃上皮細胞自噬加強,并且抑制轉(zhuǎn)運蛋白MCT1、SLC5A8的表達,高濃度組胺則會抑制瘤胃上皮細胞自噬發(fā)生。
【學(xué)位單位】：吉林大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位年份】：2019
【中圖分類】：S823
【部分圖文】：

形成自噬體、自噬溶酶體的形成及自噬體降解[82]。自噬體的形成過程如圖2-1[83]。自噬的激活受相對保守的自噬相關(guān)蛋白（Atg）的調(diào)控，自噬的啟動首先需要Ⅲ型磷脂酰肌醇激酶 3（PI3K）和 Beclin1，單層膜的延伸需要受兩個泛素化系統(tǒng)的調(diào)控，其中最主要的一個是將 LC3-Ⅰ轉(zhuǎn)變?yōu)?LC3-Ⅱ，而 LC3-Ⅱ的積累和定位到自噬小體膜上是自噬體存在和形成的標(biāo)志。自噬體的產(chǎn)生還受到自噬抑制劑雷帕霉素復(fù)合物 1（mTORC1）的調(diào)控，雷帕霉素是一種自噬的激動劑，它不但能抑制 mTORC1 的激活，還可以誘導(dǎo)自噬的發(fā)生[84]。自噬涉及到清除受損或過多的細胞器，當(dāng)線粒體功能障礙或由于外界應(yīng)激導(dǎo)致過氧化物酶體的改變

是多余氣泡排出，否則會影響后續(xù)測量。1.2.5 統(tǒng)計學(xué)分析運用 SPSS 19.0 統(tǒng)計學(xué)分析軟件。采用 One-wayANOVA 對實驗結(jié)果進行顯著性分析，結(jié)果顯示：當(dāng) P<0.05 時為差異顯著；當(dāng) P<0.01 時為差異極顯著，均具有統(tǒng)計學(xué)意義。1.3 結(jié)果與分析1.3.1 健康及 SARA 牛瘤胃上皮 MCT1、SLC5A8 轉(zhuǎn)運蛋白表達量的變化通過 Western blot 實驗觀察 MCT1、SLC5A8 轉(zhuǎn)運蛋白表達的變化，如圖 1-1所示 SARA 狀態(tài)下的奶牛的 MCT1、SLC5A8 轉(zhuǎn)運蛋白表達下降，說明發(fā)生SARA 時會抑制 SCFA 轉(zhuǎn)運蛋白的表達。

圖 1-2 A:mTOR 通路的四種蛋白 pmTOR、mTOR、p62、LC3 和內(nèi)參β-Actin正常組和 SARA 組蛋白表達量對比。B:LC3 的灰度分析。C:p62 的灰度分析。D:mTOR 的灰度分析。E:pmTOR 的灰度分析。Figure 1-2 A: Comparison of protein expression levels of the four proteins pmTOR,mTOR, p62, LC3 and internal reference β-Actin in the mTOR pathway and SARA.B: Grayscale analysis of LC3. C: Grayscale analysis of p62. D: Grayscale analysis ofmTOR. E: pmTOR grayscale analysis。1.3.3 健康及 SARA 牛瘤胃上皮透射電鏡結(jié)果透射電鏡觀察瘤胃上皮組織內(nèi)自噬泡，如圖 1-3 所示，正常牛自噬情況正常，發(fā)生 SARA 時自噬泡增多，自噬過度積累。

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本文編號：2812283