豬流行性腹瀉(Porcine epidemic diarrhea,PED)是由豬流行性腹瀉病毒(Porcine epidemic diarrhea virus,PEDV)引起豬的一種急性、接觸性腸道傳染病,以腹瀉、嘔吐、脫水、急性腸炎為特征。近年來(lái)PEDV導(dǎo)致大批仔豬死亡,給養(yǎng)豬業(yè)造成了巨大經(jīng)濟(jì)損失,但目前對(duì)其感染免疫機(jī)制的了解尚不深入。趨化因子是募集白細(xì)胞至感染部位的一類低分子量蛋白質(zhì),其趨化作用是炎癥發(fā)生過(guò)程中重要的起始步驟,也是機(jī)體天然免疫功能的一個(gè)重要方面。本研究圍繞PEDV感染免疫選題,通過(guò)體內(nèi)外試驗(yàn),探索趨化因子在PEDV感染中的作用,旨在為深入闡明PEDV的感染免疫機(jī)制提供科學(xué)依據(jù)。將6頭21日齡健康仔豬隨機(jī)分為PEDV強(qiáng)毒株感染組和陰性對(duì)照組。感染組每頭口服接種1.5×10~(6.6) TCID_(50)的PEDV;對(duì)照組接種等體積的細(xì)胞維持液。感染后3 d應(yīng)用基因表達(dá)譜芯片技術(shù)和FQ-PCR檢測(cè)回腸組織中趨化因子mRNA的表達(dá)量。結(jié)果表明,感染豬回腸組織中趨化因子MCP-1、MIP-1β、IL-8、CXCL9、CXCL10、CXCL13的mRNA表達(dá)水平顯著上調(diào)(P0.05)。為了驗(yàn)證PEDV強(qiáng)毒株感染宿主細(xì)胞后趨化因子表達(dá)水平的變化,將IPEC-J2細(xì)胞分為HBQY2016強(qiáng)毒株感染組、CV777弱毒株感染組、LPS陽(yáng)性對(duì)照組和陰性對(duì)照組。兩個(gè)病毒感染組分別接種0.5 MOI的HBQY2016強(qiáng)毒株和CV777弱毒株,陽(yáng)性對(duì)照組用10μg/mL的LPS刺激,陰性對(duì)照組加入等體積的維持液。感染后18~20 h收集細(xì)胞,兩個(gè)病毒感染組的MCP-1、MIP-1β、IL-8、CXCL9和CXCL13 mRNA的表達(dá)水平顯著上升(P0.05),細(xì)胞上清中MCP-1、MIP-1β、IL-8、CXCL9、CXCL10、CXCL13水平顯著升高(P0.05)。為了進(jìn)一步闡明趨化因子在PEDV感染中的作用,設(shè)計(jì)合成并篩選了分別對(duì)MCP-1、CXCL9、CXCL13具有較高抑制活性的siRNA,并將IPEC-J2細(xì)胞分為PEDV感染組(強(qiáng)/弱毒株)、siRNA干擾-(強(qiáng)/弱毒株)感染組、siRNA陰性(NC)-PEDV(強(qiáng)/弱毒株)感染對(duì)照組和陰性對(duì)照組。通過(guò)Transwell趨化試驗(yàn)和流式細(xì)胞術(shù)分析,與病毒感染組相比,MCP-1干擾-HBQY2016強(qiáng)毒株和CV777弱毒株感染組細(xì)胞下室內(nèi)CD14~+單核細(xì)胞的個(gè)數(shù)分別下降400個(gè)細(xì)胞(P0.05)和1152個(gè)細(xì)胞(P0.05);CXCL9干擾-HBQY2016強(qiáng)毒株和CV777弱毒株感染組的CD3~+CD4~-CD8~-γδT、CD3~+CD4~-CD8~+Tc、CD3~+CD4~+CD8~-Th和CD3~+CD4~+CD8~+Tm細(xì)胞亞群分別平均下降677、258、718、207個(gè)細(xì)胞和2605、533、2729、949個(gè)細(xì)胞(P0.05);CXCL13干擾-HBQY2016強(qiáng)毒株和CV777弱毒株感染組的CD19~+B細(xì)胞亞群分別平均下降279個(gè)細(xì)胞和164個(gè)細(xì)胞(P0.05)。上述實(shí)驗(yàn)證明,PEDV強(qiáng)毒株感染引起趨化因子(MCP-1、MIP-1β、IL-8、CXCL9、CXCL10、CXCL13)表達(dá)量顯著上調(diào)。強(qiáng)/弱毒株誘導(dǎo)產(chǎn)生的MCP-1對(duì)CD14~+單核細(xì)胞,CXCL9對(duì)CD3~+CD4~-CD8~-γδT、CD3~+CD4~-CD8~+Tc、CD3~+CD4~+CD8~-Th和CD3~+CD4~+CD8~+Tm細(xì)胞亞群,CXCL13對(duì)CD19~+B細(xì)胞具有趨化作用。
【學(xué)位單位】：河北農(nóng)業(yè)大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位年份】：2018
【中圖分類】：S858.28

【參考文獻(xiàn)】

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本文編號(hào)：2809479