豬流行性腹瀉(porcine epidemic diarrhea,PED)是由豬流行性腹瀉病毒(porcine epidemic diarrhea virus,PEDV)引起的一種急性、高度傳染性腸道疾病。自1984年起,PEDV G1a亞型一直是引起我國仔豬腹瀉的重要病原,給養(yǎng)豬業(yè)造成了巨大的經(jīng)濟損失。2010年開始,我國南方多個省份暴發(fā)了由PEDVG2b亞型變異毒株引起的仔豬腹瀉,并迅速蔓延至全國。與經(jīng)典的G1a亞型毒株相比,新出現(xiàn)的G2b亞型毒株致病性更強。由于G1a亞型疫苗株CV777不能針對G2b亞型變異毒株提供有效的保護,因此迫切需要研制G2b亞型變異毒株疫苗。本研究調(diào)查了 2015～2017年間江蘇省部分規(guī)�；i場PEDV G2b亞型變異株的流行狀況,并對本實驗室分離鑒定的1株G2b亞型變異株進行傳代致弱,為進一步研制弱毒疫苗奠定了基礎(chǔ)。1、江蘇省2015～2017年P(guān)EDV G2b亞型變異株的流行狀況調(diào)查2015～2017年間,從江蘇省發(fā)生仔豬腹瀉的規(guī)模化豬場收集臨床病料176份,通過實時熒光定量PCR方法從中檢測出19份PEDV陽性。對這19份陽性病料中的PEDV進行分離鑒定,成功分離到1株G2b亞型毒株(命名為PED-JS-2016-05-4)。以PCR從19份PEDV陽性病料中擴增PEDV的纖突蛋白(S)基因,測序和遺傳進化分析,發(fā)現(xiàn)其中17份為G2b亞型變異株,另外2份為G1b亞型毒株。檢測到的G2b亞型變異株與國內(nèi)外報道的G2b亞型變異株的S基因核苷酸同源性高達98.5～99.7%;與G1a亞型疫苗株CV777及其他毒株親緣關(guān)系比較遠,S基因核苷酸同源性為93.6～94.3%。檢測到的2個G1b亞型毒株與在美國最早發(fā)現(xiàn)的該亞型代表毒株OH851的S基因核苷酸同源性高達99.5%;與G1a亞型毒株S基因核苷酸同源性只有95.6～96.8%。研究表明,當前江蘇省主要流行的PEDV毒株為G2b亞型變異株。本研究檢測到的G2b亞型變異株與CV777疫苗毒株在S蛋白中和表位區(qū)存在較多的氨基酸差異,并且主要集中在COE中和表位區(qū),在SS6中和表位區(qū)只存在1個突變,SS2和2C10中和表位區(qū)沒有突變。此外,通過CBS在線軟件包進行S蛋白潛在糖基化位點預測發(fā)現(xiàn),與CV777疫苗毒株相比,17株G2b亞型變異株具有6個相同的潛在糖基化位點突變,其中3個位點氨基酸突變(N57V,N127I,T232I)導致對應(yīng)部位的潛在糖基化位點缺失,而另外3個氨基酸位點突變(S59N,I116T,T1193N)產(chǎn)生了新的潛在糖基化位點。與CV777相比,2株G1b亞型毒株只有1個潛在糖基化位點存在差異,即1193位氨基酸由T突變?yōu)镹產(chǎn)生了一個新的潛在糖基化位點。2、PEDV G2b亞型變異株JSX2014的致弱研究選取實驗室前期分離鑒定的PEDV G2b亞型變異株JSX2014進行致弱研究,以期培育弱毒疫苗株。JSX2014毒株在Vero細胞連續(xù)傳代后產(chǎn)生的典型CPE為:細胞腫脹、變圓,細胞單層形成網(wǎng)眼狀并逐漸崩解脫落。JSX2014毒株在細胞上可以形成大小不同的空斑,推測與不同代次病毒的復制能力有關(guān)。為了篩選到復制能力較好的毒株,在傳代過程中分別挑取形態(tài)大小差異明顯的空斑,進行空斑純化,通過測定TCID50來評價不同空斑克隆株的復制能力。結(jié)果表明,大空斑克隆株復制能力顯著優(yōu)于小空斑克隆株。因此,多次挑取大空斑進行克隆化,連續(xù)傳代至130代,獲得的毒株命名為JSX2014/ATT。選取未吸吮母乳的3日齡初生仔豬對JSX2014/ATT進行致病性試驗,每只仔豬肌肉注射2 ×107TCID50的病毒。每天觀察是否有嘔吐和腹瀉等臨床癥狀,并采集肛拭子以及血液進行PEDV檢測。5 d后處死仔豬,對腸管進行組織病理學檢查。結(jié)果顯示,感染仔豬未出現(xiàn)腹瀉相關(guān)的臨床癥狀;僅在第1 d血液中檢測到PEDV,肛拭子中不能檢測到PEDV;仔豬腸組織結(jié)構(gòu)完整,腸絨毛未發(fā)生萎縮、脫落,表明JSX2014/ATT株已經(jīng)致弱。對JSX2014/ATT株的全基因組進行測序,并且與原始的JSX2014株作了比較。兩者在S基因上共有11個核昔酸發(fā)生突變,E和N基因都只有一個核苷酸發(fā)生突變,M基因除了 2個核苷酸的突變外還有1個15 nt的插入。非結(jié)構(gòu)基因的突變主要集中在ORF1ab上,共有13個核苷酸發(fā)生突變,ORF3在第14位核苷酸插入一個T而導致翻譯提前終止。綜上所述,江蘇省近期的PEDV流行毒株為G2b亞型變異株,同時也存在少量G1b亞型毒株。通過Vero細胞連續(xù)傳代結(jié)合病毒空斑純化技術(shù),成功致弱了一株P(guān)EDV G2b亞型變異株,為進一步研制弱毒活疫苗奠定了基礎(chǔ)。
【學位單位】：揚州大學
【學位級別】：碩士
【學位年份】：2018
【中圖分類】：S852.651
【部分圖文】：

膜結(jié)構(gòu)域（１３３４－１３５６邋ａａ）以及〗個短的胞漿區(qū)（邋１３５７－１３８３邋ａａ）邋［１８］。通過與其他冠狀病毒逡逑Ｓ蛋白的同源性相比較，可將ＰＥＤＶＳ蛋白分為Ｓ１邋（１－７８９邋ａａ）和Ｓ２邋（７９０－１３８３邋ａａ）兩個逡逑結(jié)構(gòu)域（圖１．２）。當宿主細胞膜受體與Ｓ１受體結(jié)合位點結(jié)合以后，經(jīng)過一系列的細胞反逡逑應(yīng)，信號肽上酪蛋白激酶ＩＩ磷酸化的位點得以激活。Ｓ２為膜融合亞單位，包括ＨＲＩ和ＨＲ２逡逑兩部分。Ｓ蛋白在調(diào)節(jié)宿主特定受體介導病毒侵入過程中具有重要作用，受體與Ｓ蛋白結(jié)逡逑合后會導致Ｓ蛋白構(gòu)象發(fā)生改變，最終誘導病毒侵入細胞。通過對各種冠狀病毒Ｓ蛋白序逡逑列比對發(fā)現(xiàn)Ｓ２序列較Ｓ１更為保守，說明Ｓ１蛋白和Ｓ２蛋白在功能上存在差異。不同冠狀逡逑病毒的Ｓ２亞基相對比較保守是因為Ｓ２結(jié)構(gòu)域主要負責膜融合［１９］。Ｓ蛋白在病毒感染宿主逡逑時與特異性細胞受體反應(yīng)；從而促進病毒的侵入并且刺激機體產(chǎn)生中和抗體，同時Ｓ蛋白逡逑也與病毒體外細胞適應(yīng)性和病毒毒力有關(guān)，因此，Ｓ糖蛋白是開發(fā)ＰＥＤＶ疫苗的重要靶蛋逡逑白。逡逑Ｒｅｃｅｐｔｏｒ邋ｂｉｎｄｉｎｇ邐Ｆｕｓｉｏｎ逡逑Ｓ１／Ｓ２邋Ｓ２１逡逑ｓｐｉｋｅ邋ｎｗｍｗｍａｍｍａｍ邐：邋ｃ逡逑、邐＿邋＿邋＿邐邐邋—邋ｉ邐ｔ邋邋一—邋一邐—邋一？ｊ逡逑Ｓ１邐Ｓ２逡逑圖１．２ＰＥＤＶＳ基因結(jié)構(gòu)模式圖［１９］逡逑Ｆｉｇｌ．２邋Ｍｏｄｅｌ邋ｏｆ邋ＰＥＤＶ邋Ｓ邋ｇｅｎｅ逡逑ＮＴＤ：Ｓ１基因Ｎ末端功能域；Ｃ－ｄｏｍａｉｎ：邋ＳＩ基因Ｃ末端功能域；ＦＰ：融合肽；ＨＲｌ，，ＨＲ２：七肽重復逡逑序列；ＴＭ：跨膜區(qū)；Ｅ：胞內(nèi)結(jié)構(gòu)逡逑Ｍ蛋白是囊膜糖蛋白

邐１邐？邋ＩＯＷ邋Ａ邋ＪＯ？邋（ＫＪ６４５６％）逡逑圖１．３根據(jù)Ｓ基因核苷酸序列的全球ＰＥＤＶ毒株系統(tǒng)進化分析逡逑Ｆｉｇ邋１．３邋Ｐｈｙｌｏｇｅｎｅｔｉｃ邋ａｎａｌｙｓｅｓ邋ｏｆ邋ｇｌｏｂａｌ邋ＰＥＤ邋Ｖ邋ｓｔｒａｉｎｓ邋ｂａｓｅｄ邋ｏｎ邋ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ邋ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ邋ｏｆ邋ｔｈｅ邋ｓｐｉｋｅ邋ｇｅｎｅｓ逡逑

ＰＣ２２Ａ－Ｐ１００Ｃ４邐部分致弱邐ＫＵ８９３８７０逡逑ＰＣ２２Ａ－Ｐ１２０邐部分致弱邐Ｇ２ｂ邐ＫＵ８９３８７２逡逑ＰＣ２２Ａ－Ｐ１６０邐完全致弱邐ＫＵ８９３８７３逡逑的傳代致弱逡逑毒的傳代逡逑２０１４傳代細胞毒能夠在Ｖｅｒｏ細胞上傳代并產(chǎn)生明顯的細胞病變（圖３．，細胞開始產(chǎn)生ＣＰＥ，部分細胞腫脹變圓，折光性X椙�，颗粒样捂y氏赴ち己茫ㄍ跡粒�。培养４８邋ｍw螅赴饗緣模茫校�，部分显擆嬥y壹湎侗浯螅ㄍ跡牛�，阴羞h哉障赴ち己茫ㄍ跡攏�。培养ＡP玻瑁梗埃�，细胞翅岠眼状，无正常细胞存在（哇E疲�，阴羞h哉障赴醇模鈴澹緬義

本文編號：2809510