豬流行性腹瀉(porcine epidemic diarrhea,PED)是由豬流行性腹瀉病毒(porcine epidemic diarrhea virus,PEDV)引起的一種急性、高度傳染性腸道疾病。自1984年起,PEDV G1a亞型一直是引起我國(guó)仔豬腹瀉的重要病原,給養(yǎng)豬業(yè)造成了巨大的經(jīng)濟(jì)損失。2010年開(kāi)始,我國(guó)南方多個(gè)省份暴發(fā)了由PEDVG2b亞型變異毒株引起的仔豬腹瀉,并迅速蔓延至全國(guó)。與經(jīng)典的G1a亞型毒株相比,新出現(xiàn)的G2b亞型毒株致病性更強(qiáng)。由于G1a亞型疫苗株CV777不能針對(duì)G2b亞型變異毒株提供有效的保護(hù),因此迫切需要研制G2b亞型變異毒株疫苗。本研究調(diào)查了 2015～2017年間江蘇省部分規(guī)�；i場(chǎng)PEDV G2b亞型變異株的流行狀況,并對(duì)本實(shí)驗(yàn)室分離鑒定的1株G2b亞型變異株進(jìn)行傳代致弱,為進(jìn)一步研制弱毒疫苗奠定了基礎(chǔ)。1、江蘇省2015～2017年P(guān)EDV G2b亞型變異株的流行狀況調(diào)查2015～2017年間,從江蘇省發(fā)生仔豬腹瀉的規(guī)模化豬場(chǎng)收集臨床病料176份,通過(guò)實(shí)時(shí)熒光定量PCR方法從中檢測(cè)出19份PEDV陽(yáng)性。對(duì)這19份陽(yáng)性病料中的PEDV進(jìn)行分離鑒定,成功分離到1株G2b亞型毒株(命名為PED-JS-2016-05-4)。以PCR從19份PEDV陽(yáng)性病料中擴(kuò)增PEDV的纖突蛋白(S)基因,測(cè)序和遺傳進(jìn)化分析,發(fā)現(xiàn)其中17份為G2b亞型變異株,另外2份為G1b亞型毒株。檢測(cè)到的G2b亞型變異株與國(guó)內(nèi)外報(bào)道的G2b亞型變異株的S基因核苷酸同源性高達(dá)98.5～99.7%;與G1a亞型疫苗株CV777及其他毒株親緣關(guān)系比較遠(yuǎn),S基因核苷酸同源性為93.6～94.3%。檢測(cè)到的2個(gè)G1b亞型毒株與在美國(guó)最早發(fā)現(xiàn)的該亞型代表毒株OH851的S基因核苷酸同源性高達(dá)99.5%;與G1a亞型毒株S基因核苷酸同源性只有95.6～96.8%。研究表明,當(dāng)前江蘇省主要流行的PEDV毒株為G2b亞型變異株。本研究檢測(cè)到的G2b亞型變異株與CV777疫苗毒株在S蛋白中和表位區(qū)存在較多的氨基酸差異,并且主要集中在COE中和表位區(qū),在SS6中和表位區(qū)只存在1個(gè)突變,SS2和2C10中和表位區(qū)沒(méi)有突變。此外,通過(guò)CBS在線軟件包進(jìn)行S蛋白潛在糖基化位點(diǎn)預(yù)測(cè)發(fā)現(xiàn),與CV777疫苗毒株相比,17株G2b亞型變異株具有6個(gè)相同的潛在糖基化位點(diǎn)突變,其中3個(gè)位點(diǎn)氨基酸突變(N57V,N127I,T232I)導(dǎo)致對(duì)應(yīng)部位的潛在糖基化位點(diǎn)缺失,而另外3個(gè)氨基酸位點(diǎn)突變(S59N,I116T,T1193N)產(chǎn)生了新的潛在糖基化位點(diǎn)。與CV777相比,2株G1b亞型毒株只有1個(gè)潛在糖基化位點(diǎn)存在差異,即1193位氨基酸由T突變?yōu)镹產(chǎn)生了一個(gè)新的潛在糖基化位點(diǎn)。2、PEDV G2b亞型變異株JSX2014的致弱研究選取實(shí)驗(yàn)室前期分離鑒定的PEDV G2b亞型變異株JSX2014進(jìn)行致弱研究,以期培育弱毒疫苗株。JSX2014毒株在Vero細(xì)胞連續(xù)傳代后產(chǎn)生的典型CPE為:細(xì)胞腫脹、變圓,細(xì)胞單層形成網(wǎng)眼狀并逐漸崩解脫落。JSX2014毒株在細(xì)胞上可以形成大小不同的空斑,推測(cè)與不同代次病毒的復(fù)制能力有關(guān)。為了篩選到復(fù)制能力較好的毒株,在傳代過(guò)程中分別挑取形態(tài)大小差異明顯的空斑,進(jìn)行空斑純化,通過(guò)測(cè)定TCID50來(lái)評(píng)價(jià)不同空斑克隆株的復(fù)制能力。結(jié)果表明,大空斑克隆株復(fù)制能力顯著優(yōu)于小空斑克隆株。因此,多次挑取大空斑進(jìn)行克隆化,連續(xù)傳代至130代,獲得的毒株命名為JSX2014/ATT。選取未吸吮母乳的3日齡初生仔豬對(duì)JSX2014/ATT進(jìn)行致病性試驗(yàn),每只仔豬肌肉注射2 ×107TCID50的病毒。每天觀察是否有嘔吐和腹瀉等臨床癥狀,并采集肛拭子以及血液進(jìn)行PEDV檢測(cè)。5 d后處死仔豬,對(duì)腸管進(jìn)行組織病理學(xué)檢查。結(jié)果顯示,感染仔豬未出現(xiàn)腹瀉相關(guān)的臨床癥狀;僅在第1 d血液中檢測(cè)到PEDV,肛拭子中不能檢測(cè)到PEDV;仔豬腸組織結(jié)構(gòu)完整,腸絨毛未發(fā)生萎縮、脫落,表明JSX2014/ATT株已經(jīng)致弱。對(duì)JSX2014/ATT株的全基因組進(jìn)行測(cè)序,并且與原始的JSX2014株作了比較。兩者在S基因上共有11個(gè)核昔酸發(fā)生突變,E和N基因都只有一個(gè)核苷酸發(fā)生突變,M基因除了 2個(gè)核苷酸的突變外還有1個(gè)15 nt的插入。非結(jié)構(gòu)基因的突變主要集中在ORF1ab上,共有13個(gè)核苷酸發(fā)生突變,ORF3在第14位核苷酸插入一個(gè)T而導(dǎo)致翻譯提前終止。綜上所述,江蘇省近期的PEDV流行毒株為G2b亞型變異株,同時(shí)也存在少量G1b亞型毒株。通過(guò)Vero細(xì)胞連續(xù)傳代結(jié)合病毒空斑純化技術(shù),成功致弱了一株P(guān)EDV G2b亞型變異株,為進(jìn)一步研制弱毒活疫苗奠定了基礎(chǔ)。
【學(xué)位單位】：揚(yáng)州大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位年份】：2018
【中圖分類】：S852.651
【部分圖文】：

膜結(jié)構(gòu)域（１３３４－１３５６邋ａａ）以及〗個(gè)短的胞漿區(qū)（邋１３５７－１３８３邋ａａ）邋［１８］。通過(guò)與其他冠狀病毒逡逑Ｓ蛋白的同源性相比較，可將ＰＥＤＶＳ蛋白分為Ｓ１邋（１－７８９邋ａａ）和Ｓ２邋（７９０－１３８３邋ａａ）兩個(gè)逡逑結(jié)構(gòu)域（圖１．２）。當(dāng)宿主細(xì)胞膜受體與Ｓ１受體結(jié)合位點(diǎn)結(jié)合以后，經(jīng)過(guò)一系列的細(xì)胞反逡逑應(yīng)，信號(hào)肽上酪蛋白激酶ＩＩ磷酸化的位點(diǎn)得以激活。Ｓ２為膜融合亞單位，包括ＨＲＩ和ＨＲ２逡逑兩部分。Ｓ蛋白在調(diào)節(jié)宿主特定受體介導(dǎo)病毒侵入過(guò)程中具有重要作用，受體與Ｓ蛋白結(jié)逡逑合后會(huì)導(dǎo)致Ｓ蛋白構(gòu)象發(fā)生改變，最終誘導(dǎo)病毒侵入細(xì)胞。通過(guò)對(duì)各種冠狀病毒Ｓ蛋白序逡逑列比對(duì)發(fā)現(xiàn)Ｓ２序列較Ｓ１更為保守，說(shuō)明Ｓ１蛋白和Ｓ２蛋白在功能上存在差異。不同冠狀逡逑病毒的Ｓ２亞基相對(duì)比較保守是因?yàn)椋樱步Y(jié)構(gòu)域主要負(fù)責(zé)膜融合［１９］。Ｓ蛋白在病毒感染宿主逡逑時(shí)與特異性細(xì)胞受體反應(yīng)；從而促進(jìn)病毒的侵入并且刺激機(jī)體產(chǎn)生中和抗體，同時(shí)Ｓ蛋白逡逑也與病毒體外細(xì)胞適應(yīng)性和病毒毒力有關(guān)，因此，Ｓ糖蛋白是開(kāi)發(fā)ＰＥＤＶ疫苗的重要靶蛋逡逑白。逡逑Ｒｅｃｅｐｔｏｒ邋ｂｉｎｄｉｎｇ邐Ｆｕｓｉｏｎ逡逑Ｓ１／Ｓ２邋Ｓ２１逡逑ｓｐｉｋｅ邋ｎｗｍｗｍａｍｍａｍ邐：邋ｃ逡逑、邐＿邋＿邋＿邐邐邋—邋ｉ邐ｔ邋邋一—邋一邐—邋一？ｊ逡逑Ｓ１邐Ｓ２逡逑圖１．２ＰＥＤＶＳ基因結(jié)構(gòu)模式圖［１９］逡逑Ｆｉｇｌ．２邋Ｍｏｄｅｌ邋ｏｆ邋ＰＥＤＶ邋Ｓ邋ｇｅｎｅ逡逑ＮＴＤ：Ｓ１基因Ｎ末端功能域；Ｃ－ｄｏｍａｉｎ：邋ＳＩ基因Ｃ末端功能域；ＦＰ：融合肽；ＨＲｌ，，ＨＲ２：七肽重復(fù)逡逑序列；ＴＭ：跨膜區(qū)；Ｅ：胞內(nèi)結(jié)構(gòu)逡逑Ｍ蛋白是囊膜糖蛋白

邐１邐？邋ＩＯＷ邋Ａ邋ＪＯ？邋（ＫＪ６４５６％）逡逑圖１．３根據(jù)Ｓ基因核苷酸序列的全球ＰＥＤＶ毒株系統(tǒng)進(jìn)化分析逡逑Ｆｉｇ邋１．３邋Ｐｈｙｌｏｇｅｎｅｔｉｃ邋ａｎａｌｙｓｅｓ邋ｏｆ邋ｇｌｏｂａｌ邋ＰＥＤ邋Ｖ邋ｓｔｒａｉｎｓ邋ｂａｓｅｄ邋ｏｎ邋ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ邋ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ邋ｏｆ邋ｔｈｅ邋ｓｐｉｋｅ邋ｇｅｎｅｓ逡逑

ＰＣ２２Ａ－Ｐ１００Ｃ４邐部分致弱邐ＫＵ８９３８７０逡逑ＰＣ２２Ａ－Ｐ１２０邐部分致弱邐Ｇ２ｂ邐ＫＵ８９３８７２逡逑ＰＣ２２Ａ－Ｐ１６０邐完全致弱邐ＫＵ８９３８７３逡逑的傳代致弱逡逑毒的傳代逡逑２０１４傳代細(xì)胞毒能夠在Ｖｅｒｏ細(xì)胞上傳代并產(chǎn)生明顯的細(xì)胞病變（圖３．，細(xì)胞開(kāi)始產(chǎn)生ＣＰＥ，部分細(xì)胞腫脹變圓，折光性X椙�，颗粒样捂y氏赴ち己茫ㄍ跡粒Ｅ嘌矗稿澹韜�，细胞产生灭嬀壞ＣＰＥ，部分显擆嬥y壹湎侗浯螅ㄍ跡牛�，阴羞h(yuǎn)哉障赴ち己茫ㄍ跡攏Ｅ嘌罰玻瑁梗埃�，细胞翅岠眼状，无正常细胞存在（哇E疲�，阴羞h(yuǎn)哉障赴醇模鈴澹緬義

本文編號(hào)：2809510