【摘要】：口蹄疫病毒(Foot-and-Mouth Disease Virus,FMDV)主要引起偶蹄獸的口、蹄部出現(xiàn)水皰性疾病為特征的傳染性疾病。黏膜分泌性IgA是黏膜免疫的主要效應(yīng)因子。本研究以A型FMDV T細(xì)胞B細(xì)胞多表位肽(T,B cell multi-epitope peptides,TB)作為包被抗原,建立豬A型口蹄疫病毒sIgA間接ELISA方法,為評(píng)價(jià)多表位黏膜免疫疫苗提供配套的檢測(cè)方法。1.FMDV sIgA間接ELISA檢測(cè)抗原的制備及鼠抗豬IgA單抗的標(biāo)記將已構(gòu)建的T/B多表位重組表達(dá)質(zhì)粒轉(zhuǎn)化BL-21(DE3)感受態(tài)細(xì)胞,經(jīng)IPTG誘導(dǎo)表達(dá)出多表位蛋白TB,經(jīng)SDS-PAGE電泳檢測(cè)分子量為45 kDa。經(jīng)Western blot驗(yàn)證,TB蛋白具有良好的反應(yīng)原性,經(jīng)鎳柱His標(biāo)簽親和純化后測(cè)定TB蛋白濃度為0.6mg/mL。用辣根過(guò)氧化物酶(HRP)標(biāo)記試劑盒標(biāo)記鼠抗豬IgA單克隆抗體,獲得了鼠抗豬IgA-HRP酶標(biāo)抗體。2.豬A型FMDV sIgA間接ELISA方法的建立分別以純化的TB多表位蛋白、口蹄疫病毒AE蛋白、VP1蛋白和滅活病毒抗原作為包被抗原,以鼠抗豬IgA-HRP單克隆抗體為二抗,篩選間接ELISA的最佳條件。結(jié)果,最佳包被抗原是TB蛋白,包被濃度3.00μg/mL;最佳封閉液為10m M PBS配制的0.5%BSA;一抗1:2稀釋37℃孵育45min;鼠抗豬IgA-HRP單克隆抗體稀釋度為1:5000,作用條件為37℃30min,底物室溫顯色15min。通過(guò)計(jì)算40份陰性樣品酶標(biāo)儀OD_(450nm)讀數(shù)的平均值(?X)和標(biāo)準(zhǔn)差(SD)確定陰陽(yáng)性臨界值為0.209;通過(guò)對(duì)90份A型FMDV感染發(fā)病豬的鼻拭子樣品檢測(cè),敏感性為97.78%;針對(duì)A型、O型FMDV交叉感染情況,對(duì)84份O型FMDV感染豬鼻拭子樣品進(jìn)行檢測(cè),符合率為90.5%,且與豬流行性腹瀉、豬瘟、豬圓環(huán)、豬繁殖與呼吸道綜合征的特異性IgA抗體沒(méi)有交叉反應(yīng)。批內(nèi)和批間重復(fù)性試驗(yàn)的變異系數(shù)介于1.27%~7.92%,表明該方法具有良好的可重復(fù)性。
【學(xué)位授予單位】：甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2018
【分類(lèi)號(hào)】：S852.65
【圖文】：

業(yè)大學(xué) 2018 屆碩士學(xué)位，并在室溫（20-25℃）有影響，也可以設(shè)置為多）后，每使用 10μl 抗。果表達(dá)的 TB 蛋白進(jìn)行 期結(jié)果一致（圖 2-1）M1 2KDa

-2 TB 蛋白的 Western-Blot estern-Blot analysis of purif1-3：純化后的 TB 蛋白1-3:Purified TB protein盒測(cè)定 TB 蛋白濃度，通蛋白濃度為 0.6 mg/mL（

60KDa40KDa22KDa圖 2-2 TB 蛋白的 Western-Blot 分析Figure.2-2 Western-Blot analysis of purified TB protein1-3：純化后的 TB 蛋白1-3:Purified TB protein2.2 TB 蛋白的純化結(jié)果用蛋白濃度測(cè)定試劑盒測(cè)定 TB 蛋白濃度，通過(guò) BSA 標(biāo)準(zhǔn)蛋白所做的標(biāo)曲線比較，最終得出 TB 蛋白濃度為 0.6 mg/mL（圖 2-3）。

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本文編號(hào)：2806056