【摘要】：口蹄疫病毒(Foot-and-Mouth Disease Virus,FMDV)主要引起偶蹄獸的口、蹄部出現(xiàn)水皰性疾病為特征的傳染性疾病。黏膜分泌性IgA是黏膜免疫的主要效應因子。本研究以A型FMDV T細胞B細胞多表位肽(T,B cell multi-epitope peptides,TB)作為包被抗原,建立豬A型口蹄疫病毒sIgA間接ELISA方法,為評價多表位黏膜免疫疫苗提供配套的檢測方法。1.FMDV sIgA間接ELISA檢測抗原的制備及鼠抗豬IgA單抗的標記將已構建的T/B多表位重組表達質粒轉化BL-21(DE3)感受態(tài)細胞,經IPTG誘導表達出多表位蛋白TB,經SDS-PAGE電泳檢測分子量為45 kDa。經Western blot驗證,TB蛋白具有良好的反應原性,經鎳柱His標簽親和純化后測定TB蛋白濃度為0.6mg/mL。用辣根過氧化物酶(HRP)標記試劑盒標記鼠抗豬IgA單克隆抗體,獲得了鼠抗豬IgA-HRP酶標抗體。2.豬A型FMDV sIgA間接ELISA方法的建立分別以純化的TB多表位蛋白、口蹄疫病毒AE蛋白、VP1蛋白和滅活病毒抗原作為包被抗原,以鼠抗豬IgA-HRP單克隆抗體為二抗,篩選間接ELISA的最佳條件。結果,最佳包被抗原是TB蛋白,包被濃度3.00μg/mL;最佳封閉液為10m M PBS配制的0.5%BSA;一抗1:2稀釋37℃孵育45min;鼠抗豬IgA-HRP單克隆抗體稀釋度為1:5000,作用條件為37℃30min,底物室溫顯色15min。通過計算40份陰性樣品酶標儀OD_(450nm)讀數(shù)的平均值(?X)和標準差(SD)確定陰陽性臨界值為0.209;通過對90份A型FMDV感染發(fā)病豬的鼻拭子樣品檢測,敏感性為97.78%;針對A型、O型FMDV交叉感染情況,對84份O型FMDV感染豬鼻拭子樣品進行檢測,符合率為90.5%,且與豬流行性腹瀉、豬瘟、豬圓環(huán)、豬繁殖與呼吸道綜合征的特異性IgA抗體沒有交叉反應。批內和批間重復性試驗的變異系數(shù)介于1.27%~7.92%,表明該方法具有良好的可重復性。
【學位授予單位】：甘肅農業(yè)大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2018
【分類號】：S852.65
【圖文】：

業(yè)大學 2018 屆碩士學位，并在室溫（20-25℃）有影響，也可以設置為多）后，每使用 10μl 抗。果表達的 TB 蛋白進行 期結果一致（圖 2-1）M1 2KDa

-2 TB 蛋白的 Western-Blot estern-Blot analysis of purif1-3：純化后的 TB 蛋白1-3:Purified TB protein盒測定 TB 蛋白濃度，通蛋白濃度為 0.6 mg/mL（

60KDa40KDa22KDa圖 2-2 TB 蛋白的 Western-Blot 分析Figure.2-2 Western-Blot analysis of purified TB protein1-3：純化后的 TB 蛋白1-3:Purified TB protein2.2 TB 蛋白的純化結果用蛋白濃度測定試劑盒測定 TB 蛋白濃度，通過 BSA 標準蛋白所做的標曲線比較，最終得出 TB 蛋白濃度為 0.6 mg/mL（圖 2-3）。

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本文編號：2806056