【摘要】：2010年4月我國(guó)南方部分地區(qū)暴發(fā)了一種以蛋鴨產(chǎn)蛋下降為主要特征的新發(fā)傳染病,研究表明該病病原隸屬于黃病毒科(Flaviviridae),黃病毒屬(Flavivirus),即坦布蘇病毒。該病自暴發(fā)以來(lái)迅速蔓延至全國(guó)大部分養(yǎng)殖地區(qū),對(duì)我國(guó)水禽養(yǎng)殖業(yè)造成了巨大的經(jīng)濟(jì)損失。在臨床上,該病常與H9亞型禽流感呈混發(fā)或繼發(fā)感染,因此研制用于防控此兩種疫病的疫苗尤為迫切。本研究為了獲得更高滴度的抗原,首先對(duì)坦布蘇病毒的增殖條件進(jìn)行了優(yōu)化,結(jié)果表明病毒增殖的最適細(xì)胞株為BHK-21-JS株,最佳接毒劑量為0.001 MOI、最佳收獲時(shí)間為感染后60 h,為坦布蘇疫苗抗原的大規(guī)模制備提供了技術(shù)保障。本研究為建立合理的人工感染模型,將相同含量的抗原分別以腦內(nèi)注射、肌肉注射、皮下注射、靜脈注射和口服五種途徑感染35日齡櫻桃谷肉鴨,每組10只。在攻毒后每天觀察臨床癥狀并于第3 d、6 d、10 d測(cè)量各組體重進(jìn)行分析。攻毒后1 d、2 d、3 d、4d、5 d采集血樣,用蝕斑計(jì)數(shù)試驗(yàn)檢測(cè)血液中病毒載量的變化情況。同時(shí)于攻毒后第3 d隨機(jī)撲殺各攻毒組與對(duì)照組部分試驗(yàn)鴨,取脾臟樣品進(jìn)行組織病理學(xué)分析。結(jié)果顯示各攻毒組均出現(xiàn)明顯的感染坦布蘇病毒后的臨床癥狀,且以腦內(nèi)注射組最為嚴(yán)重。各攻毒組體重總體均呈現(xiàn)出明顯的下降趨勢(shì)。血清樣本噬斑計(jì)數(shù)試驗(yàn)結(jié)果表明五種攻毒途徑均可導(dǎo)致鴨產(chǎn)生明顯的病毒血癥,其中以肌肉注射組血液中病毒含量最高。病理學(xué)分析結(jié)果顯示各攻毒組均出現(xiàn)不同程度脾臟組織結(jié)構(gòu)破壞及淋巴細(xì)胞壞死等現(xiàn)象,對(duì)照組未見明顯病理變化。并將肌肉注射確定為后續(xù)滅活疫苗免疫效果判定的最佳攻毒途徑。為研究不同佐劑對(duì)二聯(lián)滅活疫苗免疫效果的影響,本研究利用卡波姆、白油、鋁膠及蜂膠作為佐劑與相同含量的滅活抗原制備成不同佐劑的二聯(lián)滅活疫苗,免疫24日齡櫻桃谷肉鴨,免疫后應(yīng)用血凝抑制試驗(yàn)和阻斷ELISA方法分別測(cè)定鴨血清中禽流感病毒和坦布蘇病毒的抗體水平,以對(duì)比不同佐劑疫苗的免疫效力。同時(shí)從抗體水平較高的組別于一免和二次免疫后選取5只進(jìn)行攻擊試驗(yàn),采集攻毒后第1天和第2天血液樣本進(jìn)行病毒含量檢測(cè),評(píng)價(jià)疫苗的免疫保護(hù)效果。結(jié)果表明白油佐劑制備的疫苗組免疫效力最好。確定了制備二聯(lián)滅活疫苗的最佳佐劑為白油佐劑。為研究不同坦布蘇病毒抗原含量對(duì)滅活疫苗免疫效果的影響,本研究以0.1 mL、0.3 mL、0.5 mL及1 mL四個(gè)不同坦布蘇病毒含量制備的二聯(lián)滅活疫苗免疫20日齡櫻桃谷肉鴨,每組10只,免疫后每周采集血液樣本檢測(cè)抗體水平,試驗(yàn)結(jié)果表明當(dāng)滅活疫苗免疫劑量為0.5 mL時(shí)即可以得到理想的免疫后抗體水平。為了完善免疫程序,另將30只20日齡非免疫櫻桃谷肉鴨隨機(jī)分為對(duì)照組、單次免疫組與兩次免疫組3組,兩次疫組于一免3周后進(jìn)行加強(qiáng)免疫。免疫后定期采集血樣分別用血凝抑制試驗(yàn)與阻斷ELISA方法檢測(cè)抗體。試驗(yàn)結(jié)果表明二次免疫后禽流感抗體及坦布蘇病毒抗體陽(yáng)性率均可達(dá)100%,免疫持續(xù)期可達(dá)18周以上。由此確定滅活疫苗最小免疫劑量為0.5 mL,滅活疫苗采取二次免疫能實(shí)現(xiàn)更為持久的免疫保護(hù)。
【學(xué)位授予單位】：貴州大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2019
【分類號(hào)】：S858.32
【圖文】：

殖條件的優(yōu)化計(jì)數(shù)方法測(cè)定BHK-21-JS細(xì)胞在不同接種劑量下種毒JS804所示，當(dāng) MOI 為 0.001 時(shí)，接毒后 60 h 病毒滴度最高，達(dá) 5.8；當(dāng) MOI 為 0.01 時(shí)，接毒后 60 h 病毒滴度為 5.4×104PFU/I 為 0.0001 時(shí)，病毒繁殖滴度上升較為緩慢，直到接毒后 7mL，隨后呈明顯下降趨勢(shì)。最后確定得到最佳接種劑量為 0接種病毒后 60 h。T i m e p o s t - i n f e c t i o n ( h )Infe0 1 2 2 4 3 6 4 8 6 0 7 2012圖 2.1 坦布蘇病毒后在不同細(xì)胞上的生長(zhǎng)曲線Fig.2.1 Growth curves of the TMUV in different cells

1.3.4 坦布蘇病毒的增殖病毒在 BHK-21 細(xì)胞上連續(xù)傳代 17 次后采用蝕斑計(jì)數(shù)法測(cè)定各代次病毒滴度，結(jié)果顯示，JS804 毒價(jià)穩(wěn)定為 5×104PFU/mL。1.3.5 禽流感病毒的增殖按 Reed-Muench 法計(jì)算病毒液的病毒含量為 108.5ELD50/0.1 mL。1.4 討論作為黃病毒屬成員的坦布蘇病毒可感染鵝、鴨等多種家禽，由于尚無(wú)有效治療方法圖 2.3 坦布蘇病毒感染 BHK-21 細(xì)胞A：對(duì)照細(xì)胞；B：細(xì)胞感染病毒 48 hFig.2.3 BHK-21 infected by TMUVA: Non-infected BHK-21 cell culture control; B: Cytopathic effect observed 48h after inoculation oduck Tembusu virus.

in→90 %酒精 1 min→85 %酒精 1 min→自來(lái)水洗 2 min→蘇木精染色來(lái)水洗 1 min→1 %鹽酸酒精分化 20 s→自來(lái)水洗 1 min→稀氨水（1 %洗或蒸餾水洗 1 min→伊紅染色 20 s 至 5 min→自來(lái)水洗 30 s→85 % %酒精 30 s→95 % I 酒精 1 min→95 % II 酒精 1 min→無(wú)水乙醇 I 2 miin→二甲苯 I 2 min→二甲苯 II 2 min→二甲苯 III 2 min→中性樹膠封片果毒后各組體重變化情況毒組體重下降明顯，其中肌肉注射組體重呈持續(xù)下降趨勢(shì)；其他攻毒較肌肉注射組明顯，但在攻毒后 6 天出現(xiàn)短暫回升，攻毒后 7 至 10總體呈下降趨勢(shì)；空白對(duì)照組體重呈現(xiàn)明顯上升趨勢(shì)。由上可知，肌呈持續(xù)下降趨勢(shì)，下降最為顯著，見圖 2.1。

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本文編號(hào)：2805793