發(fā)布時間：2020-08-27 07:12

【摘要】：2010年4月我國南方部分地區(qū)暴發(fā)了一種以蛋鴨產蛋下降為主要特征的新發(fā)傳染病,研究表明該病病原隸屬于黃病毒科(Flaviviridae),黃病毒屬(Flavivirus),即坦布蘇病毒。該病自暴發(fā)以來迅速蔓延至全國大部分養(yǎng)殖地區(qū),對我國水禽養(yǎng)殖業(yè)造成了巨大的經濟損失。在臨床上,該病常與H9亞型禽流感呈混發(fā)或繼發(fā)感染,因此研制用于防控此兩種疫病的疫苗尤為迫切。本研究為了獲得更高滴度的抗原,首先對坦布蘇病毒的增殖條件進行了優(yōu)化,結果表明病毒增殖的最適細胞株為BHK-21-JS株,最佳接毒劑量為0.001 MOI、最佳收獲時間為感染后60 h,為坦布蘇疫苗抗原的大規(guī)模制備提供了技術保障。本研究為建立合理的人工感染模型,將相同含量的抗原分別以腦內注射、肌肉注射、皮下注射、靜脈注射和口服五種途徑感染35日齡櫻桃谷肉鴨,每組10只。在攻毒后每天觀察臨床癥狀并于第3 d、6 d、10 d測量各組體重進行分析。攻毒后1 d、2 d、3 d、4d、5 d采集血樣,用蝕斑計數試驗檢測血液中病毒載量的變化情況。同時于攻毒后第3 d隨機撲殺各攻毒組與對照組部分試驗鴨,取脾臟樣品進行組織病理學分析。結果顯示各攻毒組均出現(xiàn)明顯的感染坦布蘇病毒后的臨床癥狀,且以腦內注射組最為嚴重。各攻毒組體重總體均呈現(xiàn)出明顯的下降趨勢。血清樣本噬斑計數試驗結果表明五種攻毒途徑均可導致鴨產生明顯的病毒血癥,其中以肌肉注射組血液中病毒含量最高。病理學分析結果顯示各攻毒組均出現(xiàn)不同程度脾臟組織結構破壞及淋巴細胞壞死等現(xiàn)象,對照組未見明顯病理變化。并將肌肉注射確定為后續(xù)滅活疫苗免疫效果判定的最佳攻毒途徑。為研究不同佐劑對二聯(lián)滅活疫苗免疫效果的影響,本研究利用卡波姆、白油、鋁膠及蜂膠作為佐劑與相同含量的滅活抗原制備成不同佐劑的二聯(lián)滅活疫苗,免疫24日齡櫻桃谷肉鴨,免疫后應用血凝抑制試驗和阻斷ELISA方法分別測定鴨血清中禽流感病毒和坦布蘇病毒的抗體水平,以對比不同佐劑疫苗的免疫效力。同時從抗體水平較高的組別于一免和二次免疫后選取5只進行攻擊試驗,采集攻毒后第1天和第2天血液樣本進行病毒含量檢測,評價疫苗的免疫保護效果。結果表明白油佐劑制備的疫苗組免疫效力最好。確定了制備二聯(lián)滅活疫苗的最佳佐劑為白油佐劑。為研究不同坦布蘇病毒抗原含量對滅活疫苗免疫效果的影響,本研究以0.1 mL、0.3 mL、0.5 mL及1 mL四個不同坦布蘇病毒含量制備的二聯(lián)滅活疫苗免疫20日齡櫻桃谷肉鴨,每組10只,免疫后每周采集血液樣本檢測抗體水平,試驗結果表明當滅活疫苗免疫劑量為0.5 mL時即可以得到理想的免疫后抗體水平。為了完善免疫程序,另將30只20日齡非免疫櫻桃谷肉鴨隨機分為對照組、單次免疫組與兩次免疫組3組,兩次疫組于一免3周后進行加強免疫。免疫后定期采集血樣分別用血凝抑制試驗與阻斷ELISA方法檢測抗體。試驗結果表明二次免疫后禽流感抗體及坦布蘇病毒抗體陽性率均可達100%,免疫持續(xù)期可達18周以上。由此確定滅活疫苗最小免疫劑量為0.5 mL,滅活疫苗采取二次免疫能實現(xiàn)更為持久的免疫保護。
【學位授予單位】：貴州大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2019
【分類號】：S858.32
【圖文】：

殖條件的優(yōu)化計數方法測定BHK-21-JS細胞在不同接種劑量下種毒JS804所示，當 MOI 為 0.001 時，接毒后 60 h 病毒滴度最高，達 5.8；當 MOI 為 0.01 時，接毒后 60 h 病毒滴度為 5.4×104PFU/I 為 0.0001 時，病毒繁殖滴度上升較為緩慢，直到接毒后 7mL，隨后呈明顯下降趨勢。最后確定得到最佳接種劑量為 0接種病毒后 60 h。T i m e p o s t - i n f e c t i o n ( h )Infe0 1 2 2 4 3 6 4 8 6 0 7 2012圖 2.1 坦布蘇病毒后在不同細胞上的生長曲線Fig.2.1 Growth curves of the TMUV in different cells

1.3.4 坦布蘇病毒的增殖病毒在 BHK-21 細胞上連續(xù)傳代 17 次后采用蝕斑計數法測定各代次病毒滴度，結果顯示，JS804 毒價穩(wěn)定為 5×104PFU/mL。1.3.5 禽流感病毒的增殖按 Reed-Muench 法計算病毒液的病毒含量為 108.5ELD50/0.1 mL。1.4 討論作為黃病毒屬成員的坦布蘇病毒可感染鵝、鴨等多種家禽，由于尚無有效治療方法圖 2.3 坦布蘇病毒感染 BHK-21 細胞A：對照細胞；B：細胞感染病毒 48 hFig.2.3 BHK-21 infected by TMUVA: Non-infected BHK-21 cell culture control; B: Cytopathic effect observed 48h after inoculation oduck Tembusu virus.

in→90 %酒精 1 min→85 %酒精 1 min→自來水洗 2 min→蘇木精染色來水洗 1 min→1 %鹽酸酒精分化 20 s→自來水洗 1 min→稀氨水（1 %洗或蒸餾水洗 1 min→伊紅染色 20 s 至 5 min→自來水洗 30 s→85 % %酒精 30 s→95 % I 酒精 1 min→95 % II 酒精 1 min→無水乙醇 I 2 miin→二甲苯 I 2 min→二甲苯 II 2 min→二甲苯 III 2 min→中性樹膠封片果毒后各組體重變化情況毒組體重下降明顯，其中肌肉注射組體重呈持續(xù)下降趨勢；其他攻毒較肌肉注射組明顯，但在攻毒后 6 天出現(xiàn)短暫回升，攻毒后 7 至 10總體呈下降趨勢；空白對照組體重呈現(xiàn)明顯上升趨勢。由上可知，肌呈持續(xù)下降趨勢，下降最為顯著，見圖 2.1。

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本文編號：2805793