【摘要】：目的本課題組前期研究表明針刺穴位對(duì)2,4,6-三硝基苯磺酸(2,4,6-Trinitrobenzene sulfonic acid,TNBS)誘導(dǎo)的SD大鼠潰瘍性結(jié)腸炎(Ulcerative Colitis,UC)模型有明確的療效。在此基礎(chǔ)上,本試驗(yàn)重點(diǎn)研究針刺穴位對(duì)大鼠UC模型結(jié)腸粘膜超微結(jié)構(gòu)、炎癥信號(hào)通路、氧化應(yīng)激因子以及內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激相關(guān)蛋白表達(dá)的影響,為揭示針刺治療UC的效應(yīng)機(jī)理提供新的實(shí)驗(yàn)依據(jù)。方法以TNBS/乙醇灌腸誘導(dǎo)形成SD大鼠UC模型,4天后于“足三里”穴和“曲池”穴給予手針和電針處理,連續(xù)兩周(20 min/次,隔日一次),以美沙拉嗪(500 mg/kg)灌胃作為藥物對(duì)照組。試驗(yàn)期間觀察并記錄大鼠臨床癥狀,兩周后麻醉處死大鼠,取結(jié)腸組織觀察外觀及病理變化;用掃描電鏡和透射電鏡觀察結(jié)腸黏膜超微結(jié)構(gòu)的變化;酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(Enzyme linked immunosorbent assay,ELISA)檢測(cè)組織內(nèi)炎性細(xì)胞因子、氧化應(yīng)激相關(guān)因子以及鎮(zhèn)痛相關(guān)因子含量;蛋白質(zhì)印跡法(Western Blot,WB)檢測(cè)核轉(zhuǎn)錄因子κB(Nuclear factor-κB,NF-κB)通路和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激(Endoplasmic reticulum stress,ERS)關(guān)鍵蛋白的表達(dá)水平。結(jié)果1.針刺可明顯減輕TNBS誘導(dǎo)的UC病變程度(1)與空白組比較,UC模型大鼠腹瀉嚴(yán)重,肛周粘有多量糞便,體重增長(zhǎng)緩慢,試驗(yàn)結(jié)束時(shí)糞便仍稀軟。手針或電針治療后,大鼠臨床癥狀明顯好轉(zhuǎn),其中電針組體重回升情況好于手針組和美沙拉嗪組。(2)剖檢發(fā)現(xiàn)UC模型組大鼠結(jié)腸粗大,盲腸部位腫脹嚴(yán)重,有少量出血,結(jié)腸組織形態(tài)學(xué)評(píng)分顯著高于空白組(P0.01),電針組結(jié)腸組織病變?cè)u(píng)分最低,其次為手針組和美沙拉嗪組。(3)HE染色鏡檢發(fā)現(xiàn),與空白組比較,模型組結(jié)腸黏膜細(xì)胞排列不整齊,大量炎性細(xì)胞浸潤(rùn),并有充血水腫。治療組結(jié)腸黏膜基本完整,有少量炎性細(xì)胞浸潤(rùn)和少量充血。2.針刺可減輕TNBS所致結(jié)腸組織超微結(jié)構(gòu)的損傷(1)掃描電鏡觀察結(jié)果:相比于空白組,模型組大鼠結(jié)腸黏膜損傷嚴(yán)重,絨毛破損,微絨毛嚴(yán)重缺損甚至消失,破損處可見(jiàn)有大量細(xì)菌附著。手針組腸黏膜病變顯著減輕,但黏膜表面仍有不同程度的損傷,有些微絨毛處于倒伏狀態(tài)。美沙拉嗪組類似于手針組,而電針組腸黏膜狀態(tài)接近空白組。(2)透射電鏡觀察結(jié)果:與空白組相比,模型組結(jié)腸組織微絨毛稀疏變短,細(xì)胞核染色質(zhì)分布不均,線粒體腫脹、線粒體嵴斷裂或消失,內(nèi)質(zhì)網(wǎng)擴(kuò)張。電針或手針治療后,微絨毛排列較整齊,線粒體和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)輕度腫脹,較接近于空白組。美沙拉嗪組也有類似變化。3.針刺對(duì)大鼠UC模型氧化應(yīng)激水平、炎性細(xì)胞因子和鎮(zhèn)痛因子的影響(1)在抗氧化水平方面,電針處理能顯著升高UC大鼠結(jié)腸組織內(nèi)超氧化物歧化酶(SOD)、過(guò)氧化氫酶(CAT)、谷胱甘肽過(guò)氧化物酶(GSH-Px)的表達(dá)水平,降低丙二醛(MDA)的含量(P0.01,P0.05),且效果優(yōu)于手針組和美沙拉嗪組。(2)與模型組相比,電針處理能顯著下調(diào)UC大鼠結(jié)腸組織中腫瘤壞死因子(TNF-α)、白介素(IL)-1β、髓過(guò)氧化物酶(MPO)和同型半胱氨酸(Hcy)的水平(P0.01,P0.05),同時(shí)提高IL-10的表達(dá)量。手針和美沙拉嗪組也有類似趨勢(shì)。(3)相比空白組,模型組大鼠結(jié)腸組織內(nèi)β-內(nèi)啡肽(β-EP)水平顯著降低(P0.01),5-羥色胺(5-HT)含量則明顯升高(P0.01,P0.05);而針刺處理均能逆轉(zhuǎn)上述因子變化。4.針刺對(duì)大鼠UC模型NF-κB信號(hào)通路和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激的影響(1)與空白組比較,UC模型組大鼠B淋巴細(xì)胞瘤-2基因/B淋巴細(xì)胞瘤-2相關(guān)X蛋白基因(Bcl-2/Bax)比值顯著下降(P0.01),活化-半胱天冬酶3(cleaved-caspase3)表達(dá)水平明顯升高(P0.01),針刺處理能逆轉(zhuǎn)這種變化,且電針組更接近于空白組。(2)UC模型組大鼠結(jié)腸組織內(nèi)磷酸化(p)-核因子κB抑制蛋白(IκBα)、p-p65表達(dá)水平顯著升高(P0.01),電針或手針處理能明顯抑制它們的表達(dá)(P0.01,P0.05)。(3)與空白組相比,UC模型組結(jié)腸內(nèi)葡萄糖調(diào)節(jié)蛋白78(GRP78)、磷酸化蛋白質(zhì)激酶樣內(nèi)質(zhì)網(wǎng)激酶(p-PERK)、磷酸化真核起始因子2α(p-eIF2α)表達(dá)量明顯升高(P0.01,P0.05),電針處理能顯著抑制這幾種蛋白的表達(dá)水平(P0.01)。手針組和美沙拉嗪組也有類似趨勢(shì);而磷酸化需肌醇蛋白1(p-IRE1)、X盒結(jié)合蛋白-1s(XBP-1s)、活化轉(zhuǎn)錄因子6(ATF6)等蛋白表達(dá)水平在各組之間差異不顯著(P0.05)。結(jié)論1.針刺“足三里”和“曲池”穴能明顯減輕TNBS誘導(dǎo)的大鼠潰瘍性結(jié)腸炎癥狀而具有明顯的治療作用,其中以電針效果最佳,且優(yōu)于美沙拉嗪處理組。2.針刺穴位通過(guò)下調(diào)NF-κB信號(hào)通路中關(guān)鍵蛋白磷酸化水平,減少促炎細(xì)胞因子的產(chǎn)生,而增加抑炎細(xì)胞因子的生成,并能調(diào)節(jié)氧化應(yīng)激水平和痛覺(jué)因子的水平,從而達(dá)到減輕UC的作用。3.TNBS可激活結(jié)腸細(xì)胞ERS中的未折疊蛋白反應(yīng)(UPR)信號(hào)途徑,穴位針刺可能通過(guò)調(diào)控UPR-PERK-eIF2α信號(hào)通路,降低過(guò)度的ERS,達(dá)到保護(hù)結(jié)腸黏膜的作用。
【學(xué)位授予單位】：揚(yáng)州大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2018
【分類號(hào)】：S853.61
【圖文】：

１．４．１試驗(yàn)分組及處理方案逡逑將３５只ＳＤ大鼠隨機(jī)分為５組（空白組、模型組、手針組、電針組、美沙拉嗪組）（見(jiàn)逡逑圖１）。安靜環(huán)境下飼養(yǎng)，室溫控制在（２２邋±３）邋°Ｃ范圍內(nèi)，相對(duì)濕度約為（５０邋±３）邋％，逡逑籠內(nèi)以消毒木屑為墊料，自然光照，自由飲食，預(yù)飼養(yǎng)４天以適應(yīng)環(huán)境，然后開(kāi)始試驗(yàn)。逡逑所有關(guān)于實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的操作符合揚(yáng)州大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物倫理會(huì)規(guī)定。逡逑ＳＤ大鼠逡逑邐１邐逡逑ｔ邐Ｉ逡逑｜空白組｜邋｜模型組｜邋｜手針組｜邋｜電針組｜邋｜美沙拉嗪組｜逡逑１邐邐邐！逡逑Ｉ逡逑｜ｔ；ｃ棋？邋？備逡逑生理鹽水灌＠邐５％ＴＮＢＳ逡逑（１００ｍｇ／Ｋｇ，邋５０％邋乙酵）逡逑ｔ邐邐Ｉ逡逑邐邋邐邋１邋邐逡逑僅麻醉，不治衿邐曲＊￣ｎ逡逑邐１邐（w密把－ｌｍＡ，卜ｗｍｇ？．ｊ逡逑隔天一次７共７次逡逑＇邐．邐ｆ逡逑麻醉處死并采集五清＇邋結(jié)煬組紐樣品逡逑圖１實(shí)驗(yàn)流程示意圖逡逑Ｆｉｇ．邋１邋Ｔｈｅ邋ｐｒｏｃｅｓｓ邋ｏｆ邋Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ邋ｄｉａｇｒａｍ逡逑１．４．２邋ＵＣ模型制備逡逑大鼠造模前禁食２４邋ｈ。用３％戊巴比妥鈉（３７．５邋ｍｇ／ｋｇ）的生理鹽水溶液進(jìn)行腹腔注射逡逑麻醉，然后選取直徑２．０邋ｎｉｍ，長(zhǎng)約１０邋ｃｍ的娃膠管由肛門(mén)輕緩插入約８邋ｃｍ，結(jié)腸內(nèi)丨次逡逑性灌注５％邋ＴＮＢＳ邋（１００邋ｍｇ／ｋｇ）與無(wú)水乙醇等量混合液。為確保注入的ＴＮＢＳ能夠在大腸逡逑內(nèi)彌散分布，注入后將大鼠尾巴提起，持續(xù)倒置３０邋ｓ；根據(jù)大鼠出現(xiàn)體質(zhì)量明顯Ｆ降，腹逡逑部脹大

試驗(yàn)結(jié)束時(shí)糞便仍稀軟。手針組開(kāi)始時(shí)體重也不斷下降，但造模后第７天即回升逡逑至造模前水平，肛周污染狀況有所改善，基本無(wú)糞便粘連。電針組肛周干凈，精神良好，逡逑較接近空白組，試驗(yàn)結(jié)束時(shí)體重回升最多（除空白組）（圖２）。逡逑剖檢后發(fā)現(xiàn)，空白組大鼠結(jié)腸細(xì)長(zhǎng)，呈粉紅色（見(jiàn)圖３１１１邋）。模型組大鼠結(jié)腸粗大，逡逑盲腸腫脹嚴(yán)重，結(jié)腸部位少量出血。手針組大鼠結(jié)腸仍有腫脹，在直徑和長(zhǎng)度上與模型組逡逑相似，稍有改善。電針組大鼠結(jié)腸有較明顯改善，在直徑上較接近于空白組。從各組結(jié)腸逡逑病變計(jì)分（圖３ＩＶ邋）來(lái)看，模型組病變嚴(yán)重，與空白組差異極顯著（尸＜０．０１）邋？針刺治逡逑療組與模型組比較，病變有明顯的改善，差異顯著（Ｐ＜０．０５），其中電針組較好。逡逑Ｉ邐＋邋空白組邐Ｈ邋ｒ—逡逑３５０．ｉ邋模型組邐、逡逑＋手針組逡逑ｌ邋２５０邐＾邋＾逡逑；二邋Ｉ逡逑２１°！逡逑0－Ｕ邋ｉ邋２邋ｉ邋４邋５邋６邋ｆ邋８邋ＳＩＯＩＩＩＳｌ＇ｓＭＩＳｉｅｉＶ邐畫(huà)Qi逡逑Ｄａｙｓ逡逑圖２各組大鼠體重變化（ｉ）和肛周污染狀況（ｎ）逡逑Ｆｉｇ．２邋．邋Ｔｈｅ邋ｃｈａｎｇｅ邋ｏｆ邋ｂｏｄｙ邋ｗｅｉｇｈｔ邋ｏｆ邋ｒａｔ邋（邋Ｉ邋）邋ａｎｄ邋ｐｅｒｉａｎａｌ邋ｃｏｎ

至造模前水平，肛周污染狀況有所改善，基本無(wú)糞便粘連。電針組肛周干凈，精神良好，逡逑較接近空白組，試驗(yàn)結(jié)束時(shí)體重回升最多（除空白組）（圖２）。逡逑剖檢后發(fā)現(xiàn)，空白組大鼠結(jié)腸細(xì)長(zhǎng)，呈粉紅色（見(jiàn)圖３１１１邋）。模型組大鼠結(jié)腸粗大，逡逑盲腸腫脹嚴(yán)重，結(jié)腸部位少量出血。手針組大鼠結(jié)腸仍有腫脹，在直徑和長(zhǎng)度上與模型組逡逑相似，稍有改善。電針組大鼠結(jié)腸有較明顯改善，在直徑上較接近于空白組。從各組結(jié)腸逡逑病變計(jì)分（圖３ＩＶ邋）來(lái)看，模型組病變嚴(yán)重，與空白組差異極顯著（尸＜０．０１）邋？針刺治逡逑療組與模型組比較，病變有明顯的改善，差異顯著（Ｐ＜０．０５），其中電針組較好。逡逑Ｉ邐＋邋空白組邐Ｈ邋ｒ—逡逑３５０．ｉ邋模型組邐、逡逑＋手針組逡逑ｌ邋２５０邐＾邋＾逡逑；二邋Ｉ逡逑２１°！逡逑0－Ｕ邋ｉ邋２邋ｉ邋４邋５邋６邋ｆ邋８邋ＳＩＯＩＩＩＳｌ＇ｓＭＩＳｉｅｉＶ邐畫(huà)Qi逡逑Ｄａｙｓ逡逑圖２各組大鼠體重變化（ｉ）和肛周污染狀況（ｎ）逡逑Ｆｉｇ．２邋．邋Ｔｈｅ邋ｃｈａｎｇｅ邋ｏｆ邋ｂｏｄｙ邋ｗｅｉｇｈｔ邋ｏｆ邋ｒａｔ邋（邋Ｉ邋）邋ａｎｄ邋ｐｅｒｉａｎａｌ邋ｃｏｎｔａｍｉｎａｔｉｏｎ邋（邋ＩＩ邋）逡逑Ｉ逡逑

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