【摘要】：新城疫(Newcastle Disease,ND)是由新城疫病毒(Newcastle Disease virus,NDV)強(qiáng)毒株引起的家禽急性高度接觸性傳染病,臨床癥狀主要以體溫升高、下痢、神經(jīng)損傷、呼吸障礙、消化道和呼吸道的出血為特征。NDV可以感染包括家禽在內(nèi)的至少240種鳥類和一些哺乳動物。該病在世界范圍內(nèi)廣泛流行,給養(yǎng)禽業(yè)帶來了巨大的經(jīng)濟(jì)損失。我國采取了積極免疫的措施進(jìn)行ND的防控,已經(jīng)控制了ND在我國大范圍的流行,但由于我國養(yǎng)殖場生物安全體系差、NDV免疫失敗等原因,ND的局部暴發(fā)時有發(fā)生。因此迫切需要探索新的ND防控策略。雞MDA5(Chicken Melanoma Differentiation Association antigen 5,chMDA5)是雞體細(xì)胞內(nèi)監(jiān)測外源病毒感染的模式識別受體(Pattern Recognition Receptor,PRR)之一,能夠識別NDV感染,并介導(dǎo)干擾素(Interferon,IFN)的表達(dá),啟動雞體的抗病毒天然免疫反應(yīng)。探究chMDA5對NDV感染和宿主免疫反應(yīng)的調(diào)控,有助于從機(jī)體角度闡明抗病毒和增強(qiáng)疫苗免疫力的機(jī)制,為揭示病毒和機(jī)體之間的相互作用提供新的資料,為提高NDV疫苗免疫效果提供新的參考。本課題主要研究內(nèi)容和結(jié)果如下:1.chMDA5在體外誘導(dǎo)干擾素表達(dá)的研究NDV強(qiáng)毒株F48E9和弱毒株La Sota以0.1 MOI感染DF-1細(xì)胞,在感染后8 h、12 h、24 h和48 h用RT-qPCR方法檢測chMDA5和IFN-β表達(dá)發(fā)現(xiàn),F48E9和La Sota感染DF-1細(xì)胞都能引起chMDA5表達(dá)的上調(diào),F48E9感染DF-1細(xì)胞誘導(dǎo)IFN-β表達(dá)上調(diào),而La Sota感染DF-1細(xì)胞只有在感染后24 h時誘導(dǎo)IFN-β表達(dá)上調(diào)。將F48E9和La Sota以10~5PFU/只感染SPF雞,用RT-qPCR方法檢測chMDA5和IFN-β表達(dá)發(fā)現(xiàn),F48E9和La Sota感染雞體后均能誘導(dǎo)雞體肺臟chMDA5和FN-β表達(dá)上調(diào);F48E9感染雞體后誘導(dǎo)雞體脾臟chMDA5表達(dá)上調(diào),誘導(dǎo)IFN-β表達(dá)先下調(diào)后上調(diào)再達(dá)到正常水平;La Sota感染雞體后,12 h雞體脾臟chMDA5表達(dá)下調(diào),24 h和48 h后chMDA5表達(dá)上調(diào),抑制雞體脾臟IFN-β表達(dá)。應(yīng)用帶有chMDA5的真核表達(dá)質(zhì)粒在DF-1上過表達(dá)chMDA5發(fā)現(xiàn),在體外過表達(dá)chDMA5能夠顯著誘導(dǎo)細(xì)胞IFN-β表達(dá),并抑制NDV強(qiáng)毒株F48E9的增殖。應(yīng)用RNA干擾技術(shù)抑制DF-1細(xì)胞chMDA5表達(dá)發(fā)現(xiàn),抑制細(xì)胞中chMDA5表達(dá)能夠顯著抑制細(xì)胞IFN-β表達(dá),但對NDVF48E9的增殖無顯著影響。2.誘導(dǎo)干擾素表達(dá)的chMDA5功能域研究chMDA5由1001個氨基酸殘基組成。為了探究其誘導(dǎo)干擾素表達(dá)的功能域,根據(jù)chMDA5結(jié)構(gòu)將其分為1~328 aa、1~483 aa、1~642 aa、325~1001 aa和全長等5個不同長度的片段,并以pCMV-3HA為骨架構(gòu)建了5個表達(dá)這些chMDA5不同片段的真核表達(dá)載體。轉(zhuǎn)染DF-1細(xì)胞,Western blot檢測發(fā)現(xiàn)5個片段均能在DF-1細(xì)胞中得到表達(dá)。用RT-qPCR方法檢測IFN-β表達(dá),發(fā)現(xiàn)能誘導(dǎo)雞IFN-β表達(dá)的片段都含有半胱氨酸蛋白酶激活和募集結(jié)構(gòu)域(Caspase activation and recruitment domain,CARD)。1~483 aa和1~642 aa誘導(dǎo)IFN-β表達(dá)水平差異不顯著,且和全長chMDA5誘導(dǎo)IFN-β表達(dá)水平差異不顯著。因此,chMDA5的1~483 aa可以作為研究chMDA5誘導(dǎo)IFN-β表達(dá)的功能域。3.chMDA5影響NDV對雞致病性的研究構(gòu)建并獲得了能夠表達(dá)chMDA5前483 aa的重組腺病毒rAd-MDA5和干擾chMDA5表達(dá)的重組腺病毒rAd-shM5。rAd-MDA5感染DF-1細(xì)胞后能夠介導(dǎo)chMDA5(483 aa)的表達(dá)并誘導(dǎo)雞IFN-β的表達(dá);rAd-shM5感染DF-1細(xì)胞后能夠顯著降低chMDA5和IFN-β的表達(dá),且下調(diào)F48E9感染細(xì)胞誘導(dǎo)的chMDA5和IFN-β的表達(dá)。rAd-MDA5注射雞體后能夠上調(diào)宿主chMDA5表達(dá)。與單獨(dú)F48E9感染相比,共感染rAd-MDA5和F48E9能夠顯著上調(diào)F48E9攻毒后雞體肺臟IFN-β的表達(dá)水平,降低肺臟病毒載量,并延長攻毒后雞群的存活時間。而rAd-shM5注射雞體后能夠在雞體內(nèi)抑制chMDA5和IFN-β表達(dá),但對F48E9感染后雞群的存活時間無顯著影響。4.chMDA5輔助激活適應(yīng)性免疫反應(yīng)的研究將表達(dá)chMDA5(483 aa)的重組腺病毒rAd-MDA5和NDV滅活疫苗共同免疫SPF雞。免疫后每7天采集血液,用血凝抑制(Hemagglutination Inhibition,HI)方法檢測血清抗體水平發(fā)現(xiàn),腺病毒rAd-MDA5表達(dá)的chMDA5(483 aa)增強(qiáng)了NDV滅活疫苗誘導(dǎo)的體液免疫。在二免24 h后,采集雞體脾臟,用RT-qPCR檢測IL-4、IFN-γ和MHC-Ⅱ的表達(dá),發(fā)現(xiàn)chMDA5(483 aa)增強(qiáng)了雞體這些細(xì)胞免疫相關(guān)因子的表達(dá)。在雞體攻毒前采集雞體外周血,淋巴細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,chMDA5(483 aa)提高了聯(lián)合免疫rAd-MDA5和NDV滅活疫苗雞體的淋巴細(xì)胞刺激指數(shù)。將雞體以10~4TCID_(50)/只的劑量感染NDV強(qiáng)毒株F48E9發(fā)現(xiàn),聯(lián)合免疫rAd-MDA5和NDV滅活疫苗,降低了感染引起的發(fā)病率、組織損傷、器官病毒載量和排毒。這些結(jié)果表明,chMDA(483 aa)增強(qiáng)了NDV滅活疫苗的免疫效果。綜上所述,本研究詳細(xì)闡述了NDV感染細(xì)胞和雞體后chMDA5和IFN-β的表達(dá)規(guī)律,研究了chMDA5誘導(dǎo)IFN表達(dá)的功能域,闡明了chMDA5對NDV增殖及其對雞致病性的影響,揭示了chMDA5(483 aa)增強(qiáng)NDV滅活疫苗免疫效果的機(jī)制。一方面為進(jìn)一步研究chMDA5功能提供理論基礎(chǔ),為進(jìn)一步研究chMDA5幫助宿主抵抗NDV的感染提供依據(jù);另一方面為增強(qiáng)NDV疫苗免疫效果提供了新的方法,也為ND新型疫苗開發(fā)提供了候選佐劑。
【學(xué)位授予單位】：西北農(nóng)林科技大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2019
【分類號】：S852.4
【圖文】：

第一章 新城疫病毒感染及雞體 MDA5 介導(dǎo)天然免疫研究進(jìn)展構(gòu)蛋白分別為：核衣殼蛋白（Nucleocapsid protein, NP）、磷蛋白（P、基質(zhì)蛋白（Matrix protein, M）、融合蛋白（Fusion protein, F）、酶蛋白（ Hemagglutinin neuraminidase protein, HN）、大分子蛋白（）。F 蛋白和 HN 蛋白為病毒粒子表面的纖突蛋白，NDV 病毒粒子結(jié)1 所示（Bruce S. Seal et al. 2000），基因組的各個基因及其編碼蛋白功

受體家族胞質(zhì)內(nèi)識別 RNA 的感知元件，包括 RIG-Ⅰ、MD58 基因編碼的具有 RNA 解旋酶活性的包內(nèi) PR帶帽的雙鏈或單鏈 RNA，此外 RIG-Ⅰ還能識別酶催化的由富含AT的雙鏈DNA轉(zhuǎn)錄的雙鏈RNt al. 2004; Kato H et al. 2008) 。人的 MDA5 是有酶活性的酶類。MDA5 通常識別長度超過 2000的 LGP2 也叫 RLR-3(RIG-I-like receptor 3, RLRTP 的 RNA 解旋酶。對于很多病毒而言，RIG-ⅠGP2 功能的激活。 的結(jié)構(gòu)與信號轉(zhuǎn)導(dǎo) RIG-Ⅰ具有相似的結(jié)構(gòu)，即有 N 端的 CARD（和 MDA5 介導(dǎo)的 RNA 識別和信號轉(zhuǎn)導(dǎo)原理圖(del Toral RNA recognition and signal activation by RIG-I and M

第一章 新城疫病毒感染及雞體 MDA5 介導(dǎo)天然免疫研究進(jìn)展DA5 協(xié)作后，一方面更多的 MDA5 成為激活狀態(tài)進(jìn)行纖維組裝，另的 MDA5 纖維即可完成信號轉(zhuǎn)導(dǎo)(圖 1-6)，從而幫助 MDA5 更高效 RNA 信號識別和抗病毒信號傳遞（Bruns AM et al. 2014；Zhu Q et a別的胞內(nèi)非自身 RNA 信號傳遞給接頭分子 MAVS，引起磷酸化介interferon regulatory factors, IRF3）和 NF-κb 的活化，這些因子入達(dá)，從而激起機(jī)體的先天性抗病毒免疫反應(yīng)（Rodriguez K R et al. 2圖 1-3 MDA5 結(jié)構(gòu)域組成(Berke IC et al 2013)Fig.1-3 Domain organization of MDA5(Berke IC et al 2013)

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