【摘要】：禽流感病毒(Avian Influenza virus,AIV)根據(jù)其致病性可分為高致病性禽流感(HPAI)和低致病性禽流感(LPAI)病毒,通常HPAIV對家禽表現(xiàn)為高致死率,而LPAIV對家禽的致病表現(xiàn)為從無癥狀到輕微癥狀,但是傳播范圍廣,常常導(dǎo)致混合感染而使死亡率上升。當(dāng)前流行的禽流感病毒主要包括H5、H7和H9亞型,可以跨種間傳播,甚至傳播給人,對公共衛(wèi)生產(chǎn)生巨大威脅。疫苗接種是預(yù)防流感大流行的主要策略,目前大多數(shù)季節(jié)性流感疫苗都是用雞胚生產(chǎn),需要大量的人力和物力,在大流行期間很難放大生產(chǎn),如果爆發(fā)高致病性禽流感(HPAI)病毒(如H5N6、H7N9病毒),很難在短時間大量供應(yīng)SPF雞胚。目前有多個細(xì)胞系可以用于繁殖流感病毒,常用的有MDCK、Vero細(xì)胞等,其培養(yǎng)過程簡單、增殖迅速、病毒產(chǎn)量高。然而MDCK細(xì)胞培養(yǎng)也面臨兩方面的問題:一是MDCK細(xì)胞貼壁性太強(qiáng),無法適應(yīng)工業(yè)化生產(chǎn);二是與雞胚培養(yǎng)相比,禽流感病毒在細(xì)胞上的繁殖能力不高。有研究通過對細(xì)胞進(jìn)行修飾,改變其生物學(xué)特性來解決上述問題。研究表明TIGAR(TP53-induced glycolysis and apoptosis regulator)基因能夠減少各種應(yīng)激引起的凋亡,提高細(xì)胞存活時間。唾液酸轉(zhuǎn)移酶(siat7e)基因是控制細(xì)胞貼壁程度的重要基因之一,β-半乳糖苷α-2,3-唾液酸轉(zhuǎn)移酶(ST3GAL4)基因編碼的產(chǎn)物能提高宿主細(xì)胞對禽流感病毒的敏感性。實驗室前期已經(jīng)構(gòu)建了穩(wěn)定表達(dá)TIGAR基因的MDCK細(xì)胞(TG-418-E5),和穩(wěn)定共表達(dá)Siat7e基因和ST3GAL4基因的MDCK細(xì)胞(M54),因此,本研究通過對兩個修飾的MDCK細(xì)胞進(jìn)行馴化,使之適應(yīng)無血清全懸浮培養(yǎng),并用于增殖禽流感病毒。1、TG-418-E5細(xì)胞和MDCK-siat7e-ST3GAL4(M54)細(xì)胞懸浮培養(yǎng)的馴化在細(xì)胞沒有懸浮馴化的情況下,先使用微載體來懸浮培養(yǎng)TG-418-E5細(xì)胞,分析初始細(xì)胞接種密度、微載體濃度和換液方式對細(xì)胞生長的影響,以確定在使用微載體懸浮培養(yǎng)時的最佳的培養(yǎng)條件,同時分析降低培養(yǎng)基中血清濃度對細(xì)胞狀態(tài)的影響。研究表明TG-418-E5細(xì)胞在微載體懸浮培養(yǎng)的情況下,當(dāng)微載體濃度為3 g/L、細(xì)胞初始接種密度為30×104/mL時,培養(yǎng)48h進(jìn)行半換液、72h進(jìn)行全換液,96h活細(xì)胞密度(viable cell density,VCD)可達(dá)310 × 104個/mL以上。與母本MDCK細(xì)胞相比,在含有5%血清培養(yǎng)基或低血清培養(yǎng)條件下,TG-418-E5細(xì)胞在微載體上的最大活細(xì)胞的密度高了將近23.5%(約40×104個細(xì)胞),但是在降血清過程中,兩種細(xì)胞都出現(xiàn)拉絲,細(xì)胞輪廓不清晰,生長比較緩慢等情況,因此都不適合進(jìn)行無血清馴化。M54細(xì)胞是進(jìn)行貼壁性能修飾的MDCK細(xì)胞,通過單細(xì)胞懸浮馴化、逐漸降低血清濃度的方法,獲得一個懸浮細(xì)胞株M54x。我們比較了 M54x不同細(xì)胞初始密度對活細(xì)胞數(shù)和細(xì)胞上清中的葡萄糖、乳酸濃度的影響。結(jié)果表明M54x細(xì)胞的最佳接種初始密度是60×104cells/mL,細(xì)胞生長密度最高,生長速率最快,細(xì)胞上清中葡萄糖濃度較高而乳酸濃度較低,細(xì)胞高峰密度可達(dá)到420×104cells/mL。而在72h,細(xì)胞處于對數(shù)生長期,細(xì)胞狀態(tài)較好,72h之后細(xì)胞上清中葡萄糖濃度較低而乳酸濃度越來越高,所以72h是一個臨界點,細(xì)胞上清中葡萄糖濃度和乳酸濃度不會影響病毒增殖,因此72h是病毒最佳接種時間。由于微載體的使用大大增加成本,最經(jīng)濟(jì)實用安全的方法是低血清懸浮培養(yǎng),因此選擇M54x細(xì)胞做低血清懸浮培養(yǎng)馴化是更好的選擇。2、TG-418-E5細(xì)胞與M54懸浮細(xì)胞用于增殖禽流感病毒的初步探究本研究中利用搖瓶培養(yǎng)系統(tǒng)和BIOSTATA生物反應(yīng)器,比較了H5亞型YA-5、R2344和H7N9 rGW三個禽流感疫苗候選株在這兩種細(xì)胞上的生長情況,確定病毒在不同培養(yǎng)體系的最佳接種時間、接種量、最佳胰酶濃度和最佳收獲時間。TG-418-E5細(xì)胞用微載體最佳條件培養(yǎng),培養(yǎng)后72h病毒HA效價達(dá)到最高值;與MDCK細(xì)胞相比,病毒HA效價提高了 1-2個滴度,但是該細(xì)胞利用微載體懸浮培養(yǎng)無法適應(yīng)低血清懸浮培養(yǎng),因此未做放大培養(yǎng)研究。我們在搖瓶中無血清懸浮培養(yǎng)M54x細(xì)胞,分別比較不同的MOI、TPCK-胰酶濃度和溫度對禽流感病毒增殖的影響,發(fā)現(xiàn)33℃培養(yǎng)、MOI為0.0001、TPCK-胰酶濃度為5μg/mL是最佳病毒感染條件。將3種禽流感疫苗株(H5亞型YA-5、R2344和H7亞型rGW)接種M54x懸浮細(xì)胞,72～96h后收獲病毒,病毒血凝效價HA分別可達(dá)9、8、9log2/50μL。在BIOSTAT A反應(yīng)器培養(yǎng)體系中,初步探索M54x細(xì)胞繁殖禽流感病毒的工藝參數(shù):培養(yǎng)72h后半換液,加入TPCK-胰酶至終濃度為5μg/mL,按0.0001 MOI接種3種禽流感疫苗株(H5亞型YA-5、R2344和H7亞型rGW),同時設(shè)定生物反應(yīng)器各項參數(shù)。病毒培養(yǎng)72h～96h之間收獲(每6h取樣觀察病變、測上清HA效價)產(chǎn)量最高。H5亞型YA-5在76h收獲,HA效價可達(dá)91og2/50μL;H5亞型r2344在66h收獲,HA效價為91og2/50μL;H7亞型rGW在72h收獲,HA效價是91og2/50μL。這個結(jié)果說明M54x細(xì)胞系具有無血清懸浮培養(yǎng)生產(chǎn)禽流感病毒疫苗的潛能。本試驗成功建立了 M54x懸浮細(xì)胞系并且能夠穩(wěn)定高效繁殖禽流感病毒,為禽流感疫苗生產(chǎn)中采用無血清無蛋白、無動物源性培養(yǎng)基,生物反應(yīng)器規(guī)�；囵B(yǎng)M54x細(xì)胞生產(chǎn)禽流感病毒提供了一定的實驗依據(jù)。
【學(xué)位授予單位】：揚(yáng)州大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2018
【分類號】：S852.65
【圖文】：

表達(dá)量越高，細(xì)胞的粘附程度越低。人唾液酸轉(zhuǎn)移酶ＳＴ６ＧａｌＮａｃＶ，是ＳＴ６ＧａｌＮａｃ唾液酸逡逑轉(zhuǎn)移酶家族的成員，是一種ＩＩ型高爾基膜蛋白，將唾液酸從供體ＣＭＰ－Ｎｅｕ５Ａｃ轉(zhuǎn)移至逡逑ＧａｌＮａｃ神經(jīng)節(jié)苷脂上的殘基ＧＭｌｂ形成ＧＤｌｏｃ邋（圖２和圖３）。逡逑ＧＪｏｌＫ＞＊ＳＯＴｅｓ邋Ｌ＆ｃｔｃ／ｎｅｃｌａｃｔｏ－ｓｅｎ＾ｓ逡逑Ｇｂ３邐／Ｌｃ３逡逑ＣＳ＞邋ＯＣ％Ｃ＾＞邋■？0？＜￥＞逡逑ＯｌｃＣｅｒ邐ｔ逡逑ｓｙｎ邋”邋Ｇｂ３邋ｓｙｎ邋；邐ｂ３ＧｎＴ５逡逑Ｇｌｃ－Ｃｅｒ邐ＬａｃＣｅｒ邐ＧＭ３邐ＯＤ３逡逑ＧＭ３邋▲邐ＧＯｉ邋▲逡逑ｓｙｎ邋ｗ邐ｓｙａ邋Ｔ逡逑ＧＭ２Ａ＾Ｄ２邋ｓｙｎ邐＃逡逑ＧＡ２邐Ｇ＾ｔ２邐ＧＤ２逡逑［３０＃ＣｃＩＤ邋［３０＾＾逡逑ＧＭ１／ＧＤ１ｂ邐ｆ逡逑／ＧＡ１邋￥ｙｎ邐Ｉ邐Ｉ，逡逑ＧＡ１邐＾邋ＧＭ１邐？邋ＧＤ１ｂ逡逑0Ｕ0ｍ＜Ｓ＞邋ＣｒＵ＾Ｋｓ＾邋ＯＵ＾ＣｃＥ＾逡逑ＧＭ１ｂ邐ＧＤ１ａ邐Ｇ’Ｔ１ｂ逡逑ＧＤｉ＜ｔ邋Ａ邐ＧＴＵａ邋－＾４邐ＧＯＩｂａ逡逑ＣＤ１ｃ邐０Ｔ１ａ邐ＧＱ１ｂ逡逑ａｓｍｏｓｅｎｔｓ邐ａｔｏｎｅｓ邐ｔｙｓｅｎｔｓ逡逑Ｇｓｎｇｆｉｏ＾ｓｅｒｆｅｓ逡逑圖２．邋ａ神經(jīng)節(jié)甘脂的合成途徑逡逑Ｆｉｇｕｅ邋２．邋Ｓｙｎｔｈｅｔｉｃ邋ｒｏｕｔｅ邋ｏｆ邋ａｌｐｈａ邋ｇａｎｇｌｉｏｎ邋ｇｌｙｃｏｌｉｄｅ逡逑土田等人［２２］提出ｓｉａｔ７ｅ基因存在于細(xì)胞表面

也稱為上皮素），也可以切割流感病毒的ＨＡ蛋白，它使病毒在裂解位點處形成一個單獨(dú)逡逑的精氨酸［２９］。ＴＭＰＲＳＳ２屬于ＩＩ型跨膜絲氨酸家族蛋白酶。它含有一個短Ｎ末端胞質(zhì)域，逡逑包含了一段跨膜序列、可變莖區(qū)和一個Ｃ端催化絲氨酸蛋白酶結(jié)構(gòu)域［３Ｇ］（圖４）。ＴＭＰＲＳＳ２逡逑的催化結(jié)構(gòu)域能在細(xì)胞表面脫落，禽流感病毒的蛋白酶在可以在穩(wěn)定表達(dá)ＴＭＰＲＳＳ２蛋白逡逑的重組ＭＤＣＫ細(xì)胞克隆中繁殖。逡逑ＴＭＰＲＳＳ２逡逑邐邐７０邋ｋＤａ邋邐邐逡逑，，邐３２邋ｋＤａ邐＾逡逑Ｒ２５５４２５６逡逑邐？逡逑圖４．ＴＭＰＲＳＳ２結(jié)構(gòu)圖逡逑Ｆｉｇｕｅ邋４．邋Ｔｈｅ邋ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ邋ｏｆ邋ＴＭＰＲＳＳ２邋ｇｅｎｅ逡逑研究者們開發(fā)了一種新的ＭＤＣＫ細(xì)胞系（ＭＤＣＫ－Ｓｕｓ－ＴＭＰＲＳＳ２細(xì)胞），它具有兩個逡逑主要特點：單細(xì)胞懸浮生長和穩(wěn)定表達(dá)人ＴＭＰＲＳＳ２蛋白。ＭＤＣＫ－Ｓｕｓ－ＴＭＰＲＳＳ２細(xì)胞在逡逑攪拌生物反應(yīng)器中連續(xù)傳代并在不添加外源胰蛋白酶的情況下即可繁殖Ｈ９亞型禽流感病逡逑毒，ＮＪ０２／０１株，它的血凝價能夠達(dá)到９．５１ｏｇ２／２５ｎｋ在ＭＤＣＫ－Ｓｕｓ－ＴＭＰＲＳＳ２細(xì)胞中繁逡逑殖的Ｈ９亞型禽流感疫苗與蛋源疫苗組相比，在ＳＰＦ雞中可誘導(dǎo)血清中較高的血凝素抑制逡逑性抗體滴度，并保護(hù)雞免受異種Ｈ９亞型流感病毒攻擊，顯示較低的排毒率和發(fā)病率。ＳＰＦ逡逑雞在接種疫苗后６個月，雞血清中抗體的效價依然比較高。結(jié)果顯示ＭＤＣＫ－Ｓｕｓ－ＴＭＰＲＳＳ２逡逑細(xì)胞系有希望替代雞胚繁殖Ｈ９亞型禽流感病毒。逡逑３．３穩(wěn)定表達(dá)ＴＩＧＡＲ基因的ＭＤＣＫ細(xì)朐系逡逑貼壁細(xì)胞的分離導(dǎo)致細(xì)胞死亡

減少ＲＯＳ的產(chǎn)生，免于細(xì)胞凋亡。另外，ＴＩＧＡＲ還與細(xì)胞周期阻滯蛋白、抗氧化靶蛋白逡逑共同表達(dá)，使得細(xì)胞周期停滯，以免將突變的基因帶入到下一代，兩方面共同作用來保護(hù)逡逑細(xì)胞。ＴＩＧＡＲ基因調(diào)節(jié)糖酵解的過程如圖５，抗凋亡過程如圖６。孫中濤等在ＭＤＣＫ細(xì)胞逡逑中穩(wěn)定表達(dá)了邋ＴＩＧＡＲ基因（ＴＧ－４１８－Ｅ５），提高了邋ＭＤＣＫ細(xì)胞的抗凋亡能力，不同亞型禽逡逑流感病毒在貼壁培養(yǎng)的ＴＧ－４１８－Ｅ５細(xì)胞上的血凝價比在母本ＭＤＣＫ細(xì)胞上高出１－２個滴逡逑度。逡逑Ｗ邐Ｇｌｃ＜邋＇＞邐Ｃ0２邋。邐（ｂ）邋Ｇｌｃ邋６邐Ｃ0２邋－ｉ＾ｏ逡逑Ｇｖ邋NB＇邋Ｊ邋１！桯邐Ｉ！逡逑？邐ｊ－ｉ邐Ｇ６ｐ邋＾逡逑Ｆ６Ｐ邐－Ｒ５Ｐ邋ｚ邐Ｆ６ｐ邐，邐？邋Ｒ５Ｐ邋ｚ逡逑＿ｐ邐，邋Ｉｓ邐／邋？邐，邋ｌｌ逡逑Ｔ邋．邐ＩＰ邐，邐／逡逑Ｆ１６ｂｉＰ邐？邐＾邋５邐Ｆ１．６ｂｉＰ邐ｆ邋Ｊｆ逡逑？邐ｉ逡逑￥６＾邋，」邋，」逡逑Ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ邐Ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ逡逑ＤＨＡＰ邋ＧＡ３Ｐ邐ｆ邐ＤＨＡＰ邋ＧＡ３Ｐ邐Ｔ逡逑ＲＮＡ．邋ＤＮＡ邐ＲＮＡ．邋ＤＮＡ逡逑ｉ邐Ｔ逡逑Ｐｙｒｕｖａｔｅ邋Ｌａｃｔａｌｅ邐Ｌａｃｔａ（ｅ邋ｐｙｒｕｖａ

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4 本報記者 劉坤U

本文編號：2804555