【摘要】：鴨疫里默氏桿菌病是由鴨疫里默氏桿菌(Riemerella anatipestifer,RA)引起的一種侵害雛鴨、鵝等禽類(lèi)的急性或慢性傳染病,以纖維素性心包炎、肝周炎和氣囊炎為主要臨床特征。目前RA在國(guó)內(nèi)流行血清型主要為1、2、10型,各血清型之間缺少有效交叉免疫保護(hù)性,幾乎所有血清型只與同源抗血清發(fā)生特異性反應(yīng)且RA各血清型之間的抗原結(jié)構(gòu)存在較大差異。臨床上常用實(shí)驗(yàn)室方法如ELISA、PCR進(jìn)行診斷,但這些方法耗時(shí)長(zhǎng),需要專(zhuān)業(yè)的技術(shù)人員。本研究基于抗OmpA/motb蛋白的兔多克隆抗體和RA單克隆抗體,建立一種適用于臨床的快速、簡(jiǎn)便的檢測(cè)RA血清1、2、10型的方法。1鴨疫里默氏桿菌OmpA/motb的表達(dá)及多克隆抗體的制備以RA CH3基因組DNA為模板,PCR擴(kuò)增ompA/motb基因,構(gòu)建出表達(dá)載體pET30a-OmpA/motb,將質(zhì)粒pET30a-OmpA/motb轉(zhuǎn)化至大腸桿菌BL21(DE3)菌株中,經(jīng)IPTG誘導(dǎo)表達(dá)重組蛋白OmpA/motb。Western blot結(jié)果顯示,rOmpA/motb能與血清1、2、10型RA陽(yáng)性血清發(fā)生特異性反應(yīng)。以純化的rOmpA/motb免疫新西蘭大白兔,經(jīng)三次免疫后兔血清中抗OmpA/motb蛋白的抗體效價(jià)為1:256,000,Western blot結(jié)果顯示OmpA/motb兔多抗可與血清1型、2型、10型RA菌株發(fā)生特異性結(jié)合反應(yīng),與其他菌株無(wú)反應(yīng)性。2鴨疫里默氏桿菌單克隆抗體的制備前期研究中,我們篩選到1株具有血清1、2和10型交叉免疫原性的RA脂多糖突變株RA1062。本研究以RA脂多糖突變株RA1062免疫BALB/c小鼠,細(xì)胞融合后分別以血清1、2、10型RA菌株(CH3、NJ3、HXb2)作為包被抗原,篩選出能穩(wěn)定分泌抗血清1、2、10型RA菌株的單克隆抗體雜交瘤細(xì)胞株。通過(guò)體內(nèi)誘生腹水法制備抗體,并分析獲得的腹水單抗特性。本次共獲得3株RA單克隆抗體,分別命名為2C2、2D9和3E3,3株單抗亞類(lèi)鑒定均為IgM。ELISA結(jié)果表明,2C2、2D9和3E3腹水效價(jià)依次分別為1:64,000,1:128,000,1:64,000。Western blot結(jié)果顯示,3株單抗均能與血清1、2和10型RA菌株(CH3、NJ3、Hxb2)發(fā)生特異性反應(yīng),與其他禽源致病菌不發(fā)生反應(yīng),表明獲得的單克隆抗體具有良好的血清型交叉反應(yīng)性及種屬特異性。3鴨疫里默氏桿菌免疫膠體金快速檢測(cè)技術(shù)研究應(yīng)用檸檬酸三鈉還原法制備膠體金顆粒,標(biāo)記上述制備的單克隆抗體(2C2、2D9、3E3、抗OmpA/motb兔血清)。通過(guò)對(duì)膠體金稀釋液、NC膜、金標(biāo)墊等優(yōu)化,確定了以單抗3E3標(biāo)記膠體金顆粒,以單抗2C2作為檢測(cè)線,以羊抗鼠IgG作為質(zhì)控線,制備了RA快速檢測(cè)試紙條。該試紙條能夠檢測(cè)出鴨疫里默氏桿菌血清1、2、10型菌株,但對(duì)于禽致病性大腸桿菌、沙門(mén)氏菌及巴氏桿菌不發(fā)生反應(yīng)。該試紙條最低能夠檢測(cè)出2.5×10~6CFU/mL的鴨疫里默氏桿菌。綜上所述,基于RA LPS缺失株RA1062制備的單克隆抗體研制的金標(biāo)試紙條具有良好特異性,可用于RA血清1、2、10型菌株檢測(cè)。
【學(xué)位授予單位】：安徽農(nóng)業(yè)大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2018
【分類(lèi)號(hào)】：S852.4
【圖文】：

適金標(biāo)抗體復(fù)合物平鋪于經(jīng)封閉液處理后的金標(biāo)墊上，37 ℃烘干G 稀釋至 1.5 mg/mL 作為控制線(Control line, C 線)，RA 單克隆抗g/mL、1.5 mg/mL 和 2.0 mg/mL 作為檢測(cè)線(Test line, T 線)。噴線完。取 100 μL 鴨疫里默氏桿菌 WJ4、Yb2、HXb2 菌液(2.5×109CFU液滴加至樣品墊上，觀察結(jié)果，以選擇最適的抗體反應(yīng)濃度。紙條的組裝及結(jié)果判定最佳封閉液對(duì)金標(biāo)墊進(jìn)行處理，37 ℃烘干備用。備完成的金標(biāo)抗體復(fù)合物均勻的平鋪于處理后的金標(biāo)墊上，37 ℃體金噴線儀將上述確定的最適濃度的抗體噴線于 NC 膜上，待第一干后在相同的位置重復(fù)噴線一次。如圖 1 1[76]組裝試紙條。的判定：當(dāng)檢測(cè)結(jié)果為陽(yáng)性時(shí)可見(jiàn)質(zhì)控線與檢測(cè)線均出現(xiàn)肉眼可見(jiàn)不出現(xiàn)肉眼可見(jiàn)的條帶，質(zhì)控線出現(xiàn)或不出現(xiàn)條帶時(shí)，結(jié)果均判定示)）。

及結(jié)果判定對(duì)金標(biāo)墊進(jìn)行處理，37 ℃烘干備用。標(biāo)抗體復(fù)合物均勻的平鋪于處理后的金標(biāo)墊將上述確定的最適濃度的抗體噴線于 NC 膜的位置重復(fù)噴線一次。裝試紙條。檢測(cè)結(jié)果為陽(yáng)性時(shí)可見(jiàn)質(zhì)控線與檢測(cè)線均出可見(jiàn)的條帶，質(zhì)控線出現(xiàn)或不出現(xiàn)條帶時(shí)，圖 1 1 膠體金免疫試紙條結(jié)構(gòu)示意圖Fig.1 1 The sketch map of gold immunochromatographic str

2.1.2 重組載體 pET30a-OmpA/motb 的構(gòu)建用 BamH I 和 Sal I 雙酶切目的基因片段和表達(dá)載體后，用 Ligation Mix 進(jìn)行連接并轉(zhuǎn)化至DH5α中，PCR鑒定獲得2株陽(yáng)性克隆，命名為pET30a-OmpA/motb(圖2 2A)。雙酶切鑒定結(jié)果表明目的片段大小與理論值一致(圖 2 2B)。測(cè)序結(jié)果表明，重組載體中的 ompA/motb 基因序列完全正確，表明成功構(gòu)建了重組載體 pET30a-OmpA/motb。圖 2 2 重組載體 pET30a-OmpA/motb 的構(gòu)建Fig 2 2 Construct of recombinant pET30a-OmpA/motbA.重組 pET30a-ompA 載體 PCR 鑒定; M: DL 2000 DNAMarker; 1: 陰性對(duì)照; 2~3: E.coli BL21 (DE3)菌株(含質(zhì)粒 pET30a-OmpA/motb)ompA/motb 基因擴(kuò)增產(chǎn)物; B.重組 pET30a-OmpA/motb 載體雙酶切鑒定; M: DL 10000 DNA Marker; 1: pET30a-OmpA/motb 質(zhì)粒經(jīng) BamH I和 Sal I 雙酶切產(chǎn)物; 2: pET-30a（+）質(zhì)粒經(jīng) BamH I 和 Sal I 雙酶切產(chǎn)物A. Identification of recombinant pET30a-ompA/motb by PCR; M: DL 2000 DNA Marker;2-3: The ompA/motb gene was amplified from E. coliBL21(DE3) which contains recombinant pET30a-OmpA/motb; 1:Negative control; B. Identification of recombinant pET30a-OmpA/motb bydual-enzyme digestion; B. M: DL 10000 DNAMarker; 1:

【參考文獻(xiàn)】

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1 張宇曦;韓先干;左佳坤;龔建森;韓月;范國(guó)博;王少輝;田明星;丁鏟;祁克宗;于圣青;;禽致病性大腸桿菌脂多糖核心型分布與毒力基因的相關(guān)性分析[J];微生物學(xué)通報(bào);2015年08期

2 侯灣灣;韓先干;王少輝;王小蘭;岳嘉

本文編號(hào)：2804453