發(fā)布時間：2020-08-25 19:36

【摘要】：早期胚胎會經(jīng)歷劇烈的表觀修飾變化,其中最為顯著的是囊胚之前胚胎整體持續(xù)的DNA去甲基化(DNA demetylation)過程,以及囊胚之后新生DNA甲基化(de novo DNA methylation),這兩個過程對于胚胎的質(zhì)量和發(fā)育能力,至關(guān)重要。一般認(rèn)為,de novo DNA methylation主要發(fā)生在囊胚之后的附植過程中。我們發(fā)現(xiàn),負(fù)責(zé)de novo DNA methylation最為關(guān)鍵的DNA甲基轉(zhuǎn)移酶--DNMT3B,在附植前的發(fā)育階段,即8-cell之后,在mRNA和蛋白水平都有明顯的表達(dá)。因此我們推測,胚胎在附植之前有可能已經(jīng)部分地發(fā)生了de novo DNA methylation。為了驗(yàn)證這一假設(shè),我們利用已發(fā)表的附植前胚胎DNA甲基化數(shù)據(jù),對8-cell到囊胚內(nèi)細(xì)胞團(tuán)(inner cell mass,ICM),即Dnmt3b已經(jīng)表達(dá)的這一階段的DNA甲基化動態(tài)進(jìn)行了“再分析”。數(shù)據(jù)顯示,附植前的確存在de novo DNA methylation的現(xiàn)象,在這一階段,一共有3401個基因的promoter出現(xiàn)了DNA甲基化上調(diào),占到基因綜述的28.54%。而DNA demethylation仍然是這一階段的主要趨勢,有8257個基因的promoter出現(xiàn)了DNA甲基化降低的趨勢,占到基因總數(shù)的71.46%。此外,分析還發(fā)現(xiàn),附植前de novo DNA methylation主要發(fā)生在CpG密度較高(HCG)的區(qū)域,并且與常染色體相比,X染色體發(fā)生de novo DNA methylation的比例更高。進(jìn)一步,為了了解這些甲基化變化可能的生物學(xué)意義,我們利用附植前胚胎轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù),我們對8cell到ICM的甲基化變化和基因表達(dá)變化,進(jìn)行了整合分析。結(jié)果顯示,附植前de novo DNA methylated promoter主要是傾向于對細(xì)胞增殖、細(xì)胞器功能和基因表達(dá)進(jìn)行調(diào)控,而DNA demethylated promoter則主要傾向于對細(xì)胞分化的命運(yùn)、細(xì)胞代謝能力進(jìn)行調(diào)節(jié)。在上述基礎(chǔ)上我們進(jìn)一步分析了IVF囊胚和體內(nèi)囊胚DNA甲基化修飾的差異,發(fā)現(xiàn)IVF囊胚整體的DNA甲基化水平明顯偏高。在應(yīng)當(dāng)發(fā)生de novo DNA methylation的promoter中,只有小部分出現(xiàn)上升不足的問題,而大量應(yīng)該發(fā)生DNA demethylation的基因則沒有充分地下調(diào)甲基化修飾。同時,我們還發(fā)現(xiàn)附植前體內(nèi)外胚胎Dnmts的表達(dá)并無顯著差異,因此推測IVF囊胚整體甲基化偏高的問題可能是由于DNA demethylation不充分導(dǎo)致的。
【學(xué)位授予單位】：吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2018
【分類號】：S814
【圖文】：

胚胎新生甲基化的動態(tài)特征前胚胎在囊胚之前會經(jīng)歷持續(xù)的 DNA 去甲基化（D新生 DNA 甲基化（de novo DNA methylation）。然 DNA 甲基轉(zhuǎn)移酶（DNA methyltransferases，Dnmntation 前階段，胚胎可能已經(jīng)部分啟動了 de nov假設(shè)，我們對已經(jīng)發(fā)表的小鼠早期胚胎 DNA 甲基ation bisulfite sequencing）數(shù)據(jù)，以及 RNA-seq 轉(zhuǎn)錄89]。顯示，附植前胚胎中主要負(fù)責(zé)新生甲基化的 Dnmt3因組激活之后啟動了轉(zhuǎn)錄（圖 2.1 A）。這與我們在合的（2.2 A）。進(jìn)一步我們通過 Western Blottig 和的 DNMT3B 表達(dá)(2.2 B，C)，因此我們推測在 移酶已經(jīng)啟動了新生 DNA 甲基化過程。

圖 2.2 DNMTs 在早期胚胎 mRNA 及蛋白表達(dá)Fig.2.2 The mRNA and protein levels of DNMTs in pre-implantation embryos（A）RT-qPCR 檢測體內(nèi)不同時期 DNA 甲基化相關(guān)轉(zhuǎn)移酶的 mRNA 水平（B）表示 Western Blotting 分別檢測桑椹胚胎和囊胚階段 DNMT3B 的蛋白水平（C）表示免疫熒光檢測囊胚階段 DNMT3B 的表達(dá)情況。以上結(jié)果至少進(jìn)行三次生物學(xué)重復(fù)。2.2 新生 DNA 甲基化過程中甲基化的變化情況為了進(jìn)一步確認(rèn)附植前胚胎發(fā)育階段是否發(fā)生了 de novo DNA methylation，我們對2012 年發(fā)表在 Nature 上的高通量的 DNA 甲基化（RRBS）數(shù)據(jù)進(jìn)行再分析。發(fā)現(xiàn)附植前胚胎整體呈現(xiàn) DNA 去甲基化的趨勢，且在 ICM 階段，DNA 甲基化達(dá)到最低（圖 2.3A）基于之前 Dnmt3b 和 Dnmt3l 的表達(dá)特征，我們重點(diǎn)對 8-cell 到內(nèi)細(xì)胞團(tuán)（inner cell mass，ICM）階段甲基化變化進(jìn)行更加細(xì)致的分析。與文獻(xiàn)報道及我們推測一致的是，雖然從8-cell 到 ICM 階段，總體是 DNA 甲基化下降的，但仍然有 3401 個基因 promoter 區(qū)的 DN甲基化修飾發(fā)生了上調(diào)，約占 28.54%（圖 2.3 B，C），我們將其定義為附植前的 de novDNA methylation。進(jìn)一步對不同變化倍數(shù)（fold change，F(xiàn)C）promoter 區(qū)的數(shù)量進(jìn)行分析可以看到，在甲基化升高的 promoter 中，大部分的 DNA 甲基化上升幅度不大（FC<2）

圖 2.3 8cell 到 ICM 階段，DNA 甲基化的變化情況。Fig.2.3 The change of methylation during 8cell to ICM.（A）胚胎在不同時期的甲基化水平（B）8cell 到 ICM 階段 DNA 甲基化的變化（C）8cell 到 ICM 階段，發(fā)生 de novo DNAmethylation 與 DNAdemethylation 的數(shù)量（D、E）分別表示不同 fold change 下，promoters 所占數(shù)目(D)及比例（E）2.3 DNA 甲基化過程中 CpG 分布情況具有 CpG 二核苷酸特征的 DNA 序列是甲基化修飾的主要區(qū)域，CpG 密度與 DNA 甲基化修飾狀態(tài)和動態(tài)密切相關(guān)。根據(jù)基因 Promoter 區(qū) CpG 的密度不同，可以劃分為三類：LCP（Low CpG density promoter）；ICP（intermediate CpG density promoter）；HCP（highCpG density promoter）。為了確認(rèn)，我們進(jìn)一步對 8-cell 到 ICM 階段，promoter 區(qū)的甲基化變化與 CpG 之間的關(guān)系進(jìn)行分析。數(shù)據(jù)顯示，附植前的胚胎 DNA demethylation 更加偏好于發(fā)生在 HCP，并且不同下調(diào)幅度的promoter對CpG密度沒有選擇性偏好（圖2.4 A，B）然而在de novo DNA methylation則 表 現(xiàn) 出 對 CpG 密 度 具 有 不 同 的 選 擇 。 在 上 調(diào) 較 為 劇 烈 或 劇 烈 的 promoter

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本文編號：2804115