【摘要】：豬瘟(Classical swine fever,CSF),又名豬霍亂(Hog cholera),是由豬瘟病毒(Classical Swine Fever virus,CSFV)引起的急性、熱性、高度接觸性傳染病,具有高發(fā)病率、高致死性等特點(diǎn),給全球養(yǎng)豬業(yè)造成了巨大的經(jīng)濟(jì)損失,嚴(yán)重影響了養(yǎng)豬業(yè)的健康發(fā)展。CSFV中的保護(hù)性抗原蛋白E0(E~(rns)),是該病毒內(nèi)唯一可分泌到感染細(xì)胞上清中的囊膜糖蛋白,也是病毒吸附進(jìn)入敏感細(xì)胞的必須蛋白,因此體外生產(chǎn)CSFV E0蛋白對(duì)診斷及防制CSF具有重要意義。本實(shí)驗(yàn)根據(jù)畢赤酵母的密碼子偏愛性,將CSFV E0蛋白成熟肽片段進(jìn)行優(yōu)化合成,利用PCR方法從重組質(zhì)粒yE0-sys中擴(kuò)增得到優(yōu)化后的CSFV E0成熟肽基因,將該片段與畢赤酵母載體pPICZαA分別雙酶切后進(jìn)行連接,構(gòu)建得到重組表達(dá)質(zhì)粒pPICZαA-E0,用限制性內(nèi)切酶SacⅠ將其線性化后,電轉(zhuǎn)入畢赤酵母X-33感受態(tài)細(xì)胞。經(jīng)博來霉素(Zeocin)高抗篩選后,將經(jīng)鑒定的陽性重組酵母菌進(jìn)行甲醇誘導(dǎo)分泌型表達(dá),通過將表達(dá)產(chǎn)物上清經(jīng)SDS-PAGE、Western-blot和凝膠質(zhì)譜測(cè)序分析,證實(shí)CSFV E0蛋白在畢赤酵母中成功實(shí)現(xiàn)分泌型表達(dá);通過對(duì)最佳誘導(dǎo)時(shí)間、溶氧量、最佳甲醇誘導(dǎo)濃度等條件進(jìn)行摸索優(yōu)化,得到了CSFV E0蛋白在畢赤酵母中分泌表達(dá)的最佳條件,即在28℃的誘導(dǎo)溫度下,培養(yǎng)搖瓶體積1/10的菌液,并在表達(dá)培養(yǎng)基中添加1%Tween-80,同時(shí)始終保持1%的甲醇誘導(dǎo)終濃度,誘導(dǎo)表達(dá)72h時(shí)表達(dá)量可達(dá)到峰值。按此表達(dá)條件,在比較重組酵母菌不同轉(zhuǎn)化子表達(dá)量的差異后,選用篩選得到的優(yōu)勢(shì)菌株進(jìn)行表達(dá),誘導(dǎo)分泌72h時(shí),表達(dá)量達(dá)到25.6mg/L。經(jīng)過重復(fù)性實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證,本研究構(gòu)建的重組酵母菌pPICZαA-E0-X33能夠在畢赤酵母中實(shí)現(xiàn)穩(wěn)定的分泌表達(dá),且將表達(dá)菌液上清進(jìn)行超濾濃縮后,使用鎳離子金屬親和層析柱進(jìn)行純化,得到了大小約37kDa具有N-連接的糖基化CSFV E0蛋白,為監(jiān)測(cè)、診斷和防制CSF及研發(fā)有關(guān)CSFV E0蛋白的生物制品提供了物質(zhì)條件。
【學(xué)位授予單位】：湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2018
【分類號(hào)】：S852.651

【參考文獻(xiàn)】

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本文編號(hào)：2804081