【摘要】：大腸桿菌(E. coli)是奶牛乳房炎(bovine mastitis)最主要的環(huán)境致病菌,給奶牛養(yǎng)殖業(yè)造成了巨大的經(jīng)濟(jì)損失。本研究首先對北京及周邊地區(qū)的奶牛乳房炎大腸桿菌進(jìn)行了流行病學(xué)調(diào)查,細(xì)菌分離鑒定結(jié)果顯示,2012年9月-2013年10月從北京、河北和天津的6個規(guī)�；膛霾杉�663份奶牛乳房炎樣本中,分離出大腸桿菌70株,流行率為10.6%。大腸桿菌引發(fā)的奶牛乳房炎是通過自身的粘附性菌毛定植在奶牛乳腺上皮細(xì)胞,在奶牛乳腺內(nèi)大量繁殖,繼而產(chǎn)生多種毒素導(dǎo)致乳腺組織的炎癥。為進(jìn)一步分析乳房炎源性大腸桿菌的流行特征,根據(jù)文獻(xiàn)報道通過PCR的方法對分離的大腸桿菌進(jìn)行了種系分群,毒力因子檢測和耐藥性分析。結(jié)果顯示,奶牛乳房炎源性大腸桿菌主要種系進(jìn)化群為B1群(58.6%)和A群(35.7%),流行的主要毒力基因為f17A(15.7%),irp2(14.3%),astA (10.0%), iucD (7.1%)和colV (5.7%),而且B1群大腸桿菌比A群毒力因子分布更加廣泛；大多數(shù)分離的大腸桿菌(87.1%)具有耐藥性,耐藥性最強(qiáng)的是鏈霉素、卡那霉素和氨芐西林,而且B1群大腸桿菌比A群耐藥性要強(qiáng),其中鏈霉素耐藥表型與基因型具有一致性。 先前的報道和前期對大腸桿菌毒力因子的調(diào)查結(jié)果均顯示,F17菌毛是乳房炎源性大腸桿菌的優(yōu)勢菌毛,所以本研究擬通過制備F17菌毛亞單位疫苗對大腸桿菌性奶牛乳房炎進(jìn)行防控。在本研究中,首先以分離的大腸桿菌E-BJ-1菌株為模板,通過PCR方法擴(kuò)增了f17A基因,將該基因與pET28a載體連接構(gòu)建了f17A-pET28a原核表達(dá)載體,經(jīng)測序驗證后轉(zhuǎn)化大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞BL21(DE3)制備了F17A蛋白原核表達(dá)菌株；對重組菌株經(jīng)1mM IPTG誘導(dǎo)后,F17A蛋白表達(dá)明顯增強(qiáng),隨著誘導(dǎo)時間的延長,表達(dá)量逐漸增加,在誘導(dǎo)4h后己達(dá)到較高水平,SDS-PAGE分析F17A蛋白主要以包涵體的形式存在；隨后對誘導(dǎo)菌體進(jìn)行超聲破碎裂解,以包涵體溶解液溶解目的蛋白,利用重組蛋白的His標(biāo)簽對其進(jìn)行了親和層析純化,經(jīng)蛋白復(fù)性處理后,獲得了高質(zhì)量的F17A重組蛋白。 隨后,將F17A重組蛋白作為抗原,MF59作為佐劑,制備了F17A-MF59亞單位疫苗,并對疫苗的免疫學(xué)特性進(jìn)行了評價。安全性試驗結(jié)果顯示,疫苗免疫后小鼠精神、食欲均未出現(xiàn)異常,剖檢小鼠內(nèi)臟器官完好,未出現(xiàn)異常病理變化,說明該疫苗的安全性良好；免疫原性分析結(jié)果顯示,疫苗免疫后小鼠對于F17A蛋白的特異性抗體水平明顯高于無佐劑組,而且持續(xù)時間更長,抗體亞類以IgG1和IgG2a為主,說明MF59佐劑不僅能有效增強(qiáng)機(jī)體的體液免疫,對于Thl型細(xì)胞介導(dǎo)的細(xì)胞免疫也有較強(qiáng)的促進(jìn)作用；存活率試驗結(jié)果顯示,疫苗免疫后小鼠攻毒的存活率要顯著高于未免疫組,而且恢復(fù)正常所需時間更短；主要組織器官載菌量和組織病理學(xué)分析結(jié)果顯示,F17A-MF59疫苗免疫組小鼠的主要內(nèi)臟器官(肝臟、脾臟、腎臟)在時間和細(xì)菌殘留數(shù)量上對大腸桿菌的清除效率要顯著高于未免疫組,特別是肝臟和脾臟,而且F17A-MF59疫苗免疫攻毒組小鼠的病理損傷程度比未免疫攻毒組小鼠有所降低；T淋巴細(xì)胞亞群分析結(jié)果顯示,與正常組相比,未免疫攻毒組CD4+和CD8+T細(xì)胞比例均出現(xiàn)顯著降低,F17A-MF59免疫攻毒組小鼠CD4+T細(xì)胞比例出現(xiàn)顯著升高,說明MF59能顯著增強(qiáng)機(jī)體的體液免疫反應(yīng),但CD8+T細(xì)胞比例發(fā)生了顯著的降低(降低幅度低于未免疫組)這可能由于攻毒后小鼠由于細(xì)菌的感染,機(jī)體的免疫機(jī)能受損,或者大腸桿菌主要是胞外致病菌,細(xì)胞免疫機(jī)能受到抑制所致�？偟目磥�,F17A-MF59疫苗能有效增強(qiáng)機(jī)體對于大腸桿菌的抗感染免疫反應(yīng),尤其是體液免疫,對于大腸桿菌感染具有良好的免疫保護(hù)效果,該研究證實F17A-MF59疫苗具有一定的應(yīng)用價值,為進(jìn)一步研究奶牛乳房炎相關(guān)疫苗提供了理論依據(jù)和實踐基礎(chǔ)。
【學(xué)位授予單位】：中國農(nóng)業(yè)大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號】：S852.61
【圖文】：

1.4.1病原學(xué)大腸桿菌(^Escherichia coU, E.coli)為革蘭氏陰性短桿菌（圖1-1A),大小為0.5-3 (jjti。周身鞭毛，能運動，無芽孢（圖1-1B-C)。好氧及兼性厭氧，在有氧條件下生長良好，最適生長溫度為37°C，最適生長pH為6.8-8.0。大部分菌株能發(fā)酵乳糖產(chǎn)酸產(chǎn)氣，可分解葡萄糖、麥芽糖、甘露醇、木膠糖和阿拉伯膠等。大腸桿菌的抗原構(gòu)造主要由菌體（0)、鞭毛（H)和莢膜（K)組成。：

本文編號：2803991