【摘要】：本研究結(jié)合當(dāng)前豬繁殖與呼吸障礙綜合征病毒(Porcine reproductive and respiratory syndrome virus,PRRSV)致病機(jī)制、疾病防控及病毒基因功能研究進(jìn)展,以歐洲型PRRSV(RRSV-1)的ORF5編碼蛋白為主要免疫原,利用Bac-to-Bac~?桿狀病毒-昆蟲細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng),采用4種不同的蛋白表達(dá)策略,包裝制備由GP5和M蛋白組成的歐洲型PRRSV病毒樣顆粒(Virus-like particles,VLPs),并通過(guò)鼻腔黏膜免疫途徑分析其免疫原性。首先以本實(shí)驗(yàn)室保存的歐洲型PRRSV LV株基因組為模板,通過(guò)RT-PCR方法獲得PRRSV-1 GP5和M基因,利用生物信息學(xué)及相應(yīng)軟件分別對(duì)兩種基因的遺傳進(jìn)化關(guān)系及其編碼蛋白結(jié)構(gòu)進(jìn)行分析;同時(shí)從豬肺巨噬細(xì)胞中擴(kuò)增獲得豬IFN-λ1基因,并將其與PRRSV M基因融合,信號(hào)肽和跨膜區(qū)分析顯示,IFN-λ1的融合可能不影響M蛋白表達(dá)。進(jìn)而將GP5、M或pIFN-λ1基因分別克隆到桿狀病毒穿梭載體pFast Bac HTA/C或pFastBac Dual中,采用熱激法將重組穿梭質(zhì)粒轉(zhuǎn)化至DH10~?Bac大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞;使用藍(lán)白斑篩選技術(shù)獲得重組桿粒rB-GP5、rB-M、rB-pIFNλ1、rB-M-pIFNλ1或rBD-GP5-M;采用陽(yáng)離子轉(zhuǎn)染方法將重組桿粒轉(zhuǎn)染至SF9細(xì)胞,拯救重組桿狀病毒。重組桿狀病毒擴(kuò)大培養(yǎng)至第二代,采用酶聯(lián)免疫斑點(diǎn)實(shí)驗(yàn)法測(cè)定重組桿狀病毒滴度,同時(shí)利用Western Blot、間接免疫熒光等方法檢測(cè)GP5和M蛋白的表達(dá)情況;然后設(shè)置病毒感染不同時(shí)間點(diǎn)檢測(cè)GP5和M蛋白的表達(dá)情況,以確定病毒樣顆粒的最佳收獲時(shí)間;使用無(wú)血清表達(dá)系統(tǒng)大量制備PRRSV VLPs,收集細(xì)胞培養(yǎng)上清,采用蔗糖墊超速離心、蔗糖密度梯度離心策略進(jìn)行純化,Western blot鑒定GP5和M均存在后,利用透射電鏡觀察所收集的VLPs的形態(tài);最后以小鼠為試驗(yàn)動(dòng)物,通過(guò)鼻腔免疫策略及免疫后體液免疫、細(xì)胞免疫及黏膜免疫指標(biāo)的檢測(cè),分析VLPs的免疫原性,同時(shí)添加A5佐劑,并對(duì)VLPs-A5復(fù)合物的免疫原性進(jìn)行了評(píng)價(jià)。結(jié)果顯示,GP5和M蛋白共表達(dá)策略,即利用pFastBac Dual載體,構(gòu)建重組桿粒rBD-GP5-M,包裝并拯救同時(shí)攜帶PRRSV-1 GP5和M蛋白基因的重組桿狀病毒rBDV-GP5-M,感染無(wú)血清懸浮培養(yǎng)的SF9細(xì)胞可以成功包裝出具有PRRSV相似形態(tài)結(jié)構(gòu)的VLPs。將純化的VLPs作為免疫原,通過(guò)鼻腔免疫途徑免疫小鼠,整個(gè)試驗(yàn)過(guò)程中小鼠的體重呈現(xiàn)穩(wěn)定上升趨勢(shì),免疫過(guò)程沒(méi)有引起小鼠過(guò)于強(qiáng)烈的應(yīng)激反應(yīng);單獨(dú)使用VLPs和VLPs+A5均能通過(guò)鼻腔免疫途徑誘導(dǎo)小鼠局部sIgA分泌量增加,及全身性具有中和作用的IgG抗體水平升高;免疫應(yīng)答類型是以B細(xì)胞免疫應(yīng)答為主的體液免疫;A5遞送系統(tǒng)能夠讓VLPs緩慢釋放,使得機(jī)體的抗體水平保持在持續(xù)上升的狀態(tài),提供長(zhǎng)期的免疫保護(hù),表明PRRSV-1 VLPs具有開發(fā)成安全有效的新型黏膜疫苗的潛能,A5遞送系統(tǒng)可增強(qiáng)粘膜免疫應(yīng)答水平。
【學(xué)位授予單位】：吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2018
【分類號(hào)】：S852.4
【圖文】：

且自身具有良好的佐劑功能，從而能更加有效的激活固有免疫和具有良好的應(yīng)用前景。 VLPs 的結(jié)構(gòu)多樣性s 的不同導(dǎo)致其結(jié)構(gòu)和功能上存在差異，一般分為無(wú)囊膜和有囊膜兩類步細(xì)分為單衣殼蛋白 VLPs 和多衣殼蛋白 VLPs。無(wú)囊膜 VLPs 一般僅，而有囊膜VLPs一般同時(shí)包含病毒的囊膜蛋白和表達(dá)宿主細(xì)胞的細(xì)胞 VLPs 是由單個(gè)衣殼蛋白組成，如批準(zhǔn)上市的 HPV VLPs，這類 VLP系統(tǒng)或真核表達(dá)系統(tǒng)進(jìn)行表達(dá)，還可以采用無(wú)細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng)進(jìn)行包P 使用大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)、桿狀病毒昆蟲細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng)及酵母表達(dá)系統(tǒng)5, 6]。而由多個(gè)衣殼蛋白組成的無(wú)囊膜 VLPs 一般來(lái)說(shuō)相對(duì)復(fù)雜，這類要較高級(jí)的真核宿主細(xì)胞，如酵母、昆蟲細(xì)胞或植物細(xì)胞等，可以在同達(dá)多種用于組裝 VLPs 的衣殼蛋白[3]。有囊膜的病毒在組裝和出芽的過(guò)主細(xì)胞內(nèi)獲得脂質(zhì)體囊膜，一種或多種具有中和表位的糖蛋白錨定在囊上，這類 VLPs 相對(duì)于無(wú)囊膜的 VLPs 來(lái)說(shuō)，其結(jié)構(gòu)分布不均勻?qū)е缕?

VLPs 由于其結(jié)構(gòu)具有多樣性導(dǎo)致其功能也存在多樣性，目前最廣為人知的就是可為免疫原進(jìn)行應(yīng)用，如目前世面上所應(yīng)用的各種 VLPs 疫苗均基于此功能設(shè)計(jì)[9]。對(duì)囊膜 VLPs 還可以攜帶與其不相關(guān)的其他病毒的結(jié)構(gòu)蛋白或同種病毒不同亞型的結(jié)構(gòu)，例如 McGinnes 等人成功的在 NDV VLPs 上插入了 RSV 的 F 蛋白和 G 蛋白[10]；Pus人在 IAV VLPs 表面插入了 3 個(gè)不同亞型的 HA 蛋白[11]。這些混合 VLPs 體現(xiàn)出了一種的疫苗設(shè)計(jì)策略。由于 VLP 的特殊結(jié)構(gòu)允許插入多種重復(fù)的抗原蛋白并展示在顆粒表面，因此將不抗原串聯(lián)或通過(guò)化學(xué)耦聯(lián)在一起展示在 VLPs 表面的策略已經(jīng)被應(yīng)用于新型 VLPs 疫計(jì)當(dāng)中[12-14]，同時(shí)分子量較大的抗原也會(huì)增加抗體反應(yīng)，從而打破了抗原表位的限制以 HBV 核心抗原為骨架設(shè)計(jì)的多種疫苗均基于此特點(diǎn)設(shè)計(jì)[15]。此外一些有囊膜或無(wú)囊膜但包含病毒的核衣殼蛋白 VLPs 能夠同時(shí)包裹蛋白質(zhì)、小微粒、核酸等物質(zhì)，人們利用這一特性將此類 VLPs 設(shè)計(jì)成為抗原物質(zhì)或藥物的遞送，使得抗原或藥物能夠被靶向遞送到發(fā)揮作用的細(xì)胞、組織或器官部位。如 Kawanoeswani 等人利用 SV40 VLPs 或逆轉(zhuǎn)錄病毒 VLPs 包裹運(yùn)輸核酸[16, 17]。

展示在昆蟲細(xì)胞表面。桿狀病毒-昆蟲細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng)還常被用來(lái)表膜或無(wú)囊膜，分泌型或胞內(nèi)型（圖 1.1.6-A）。將外源蛋白與桿狀合表達(dá)，還可以將外源蛋白靶向到昆蟲細(xì)胞表面，進(jìn)一步隨桿狀狀病毒表面（圖 1.1.6-B）。桿狀病毒還可以用來(lái)作為類似于 AAV基因，使用兩種桿狀病毒分別表達(dá) AAV 的 rep 蛋白和 cap 蛋白，毒來(lái)攜帶和擴(kuò)增所目的 DNA（GOI,Gene of interest），共感染細(xì)胞重組 re-AAV（圖 1.1.6-C）[32]。桿狀病毒-昆蟲細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng)還可統(tǒng)，將外源基因插入到哺乳動(dòng)物細(xì)胞啟動(dòng)子下游，利用昆蟲細(xì)胞染哺乳動(dòng)物細(xì)胞，從而將外源基因帶入哺乳動(dòng)物細(xì)胞進(jìn)行表達(dá)（病毒只能在昆蟲細(xì)胞內(nèi)增殖，因此有望利用這一特性將其設(shè)計(jì)疫苗，以改善目前病毒載體疫苗使用過(guò)程中的安全性問(wèn)題。

【參考文獻(xiàn)】

相關(guān)期刊論文 前3條

1 李冰;劉麗穎;王輝暖;周鐵忠;;歐洲型豬繁殖與呼吸綜合征病毒感染仔豬病理學(xué)特征及其組織內(nèi)病毒分布[J];動(dòng)物醫(yī)學(xué)進(jìn)展;2015年07期

2 曹永芝;馬衛(wèi)明;陳書民;柴同杰;宋移福;賀加雙;劉蓮蓮;謝冰;;高致病性豬繁殖與呼吸綜合征病毒(PRRSV)氣溶膠的發(fā)生與傳播機(jī)制[J];中國(guó)獸醫(yī)學(xué)報(bào);2010年02期

3 孫穎杰,孫延峰,潘鳳城,蘇永生,劉宏智,徐景清,曹運(yùn)良,張杰,盧桂琴;豬生殖和呼吸綜合征的檢疫和診斷[J];中國(guó)獸醫(yī)雜志;1997年02期

本文編號(hào)：2803913