【摘要】：沙門(mén)菌是一種人獸共患性的病原菌,既可引起人的食源性疾病,又對(duì)養(yǎng)禽業(yè)造成嚴(yán)重的威脅,其中禽源沙門(mén)菌占有重要的地位。宿主專(zhuān)嗜性的雞白痢沙門(mén)菌可感染不同日齡的雞引起急性或慢性傳染病,不僅能水平傳播,還能垂直傳播,對(duì)養(yǎng)禽業(yè)危害巨大。雞白痢傳統(tǒng)的檢測(cè)方法主要是玻板凝集試驗(yàn)檢測(cè)抗體和PCR方法檢測(cè)病原。玻板凝集試驗(yàn)雖然簡(jiǎn)便快速,但是受主觀判斷影響較大;而多重PCR檢測(cè)技術(shù),雖然特異性好,但儀器和試劑的成本較高。因此,急需建立一種簡(jiǎn)便快速、靈敏性高、特異性強(qiáng)而成本又低的雞白痢檢測(cè)方法。脂多糖(Lipopolysaccharides,LPS)的O抗原多糖鏈高度可變,特異性地決定了細(xì)菌的血清型,具有良好的免疫原性和抗原性。以此建立檢測(cè)方法可特異性地檢測(cè)雞白痢沙門(mén)菌的感染抗體,對(duì)雞白痢的檢疫和凈化尤為重要。本研究采集了 2017-2018年華東地區(qū)疑似沙門(mén)菌感染的病料,首先進(jìn)行沙門(mén)菌的分離培養(yǎng),通過(guò)mPCR和血清學(xué)方法進(jìn)行血清型鑒定,并測(cè)定其對(duì)22種常用抗生素的敏感性,其次提取并純化雞白痢沙門(mén)菌分離株S6702和S44的LPS,建立檢測(cè)雞白痢沙門(mén)菌抗體的間接ELISA方法。1.2017-2018年華東地區(qū)禽源沙門(mén)菌的分離鑒定及耐藥性分析2017-2018年期間,從華東地區(qū)疑似家禽沙門(mén)菌感染病例采樣分離,利用mPCR和血清學(xué)方法,共鑒定出71株沙門(mén)菌,其中鼠傷寒沙門(mén)菌33株,雞白痢沙門(mén)菌25株,腸炎沙門(mén)菌10株,紐波特沙門(mén)菌2株和德?tīng)柋吧抽T(mén)菌1株。通過(guò)藥敏試驗(yàn)對(duì)71株沙門(mén)菌分離株進(jìn)行耐藥性測(cè)定,結(jié)果顯示,所分離的沙門(mén)菌對(duì)β-內(nèi)酰胺類(lèi)、大環(huán)內(nèi)酯類(lèi)的抗生素的耐藥率較高。71株細(xì)菌的多重耐藥率是92.96%。由此可見(jiàn),2017-2018年分離到的沙門(mén)菌多重耐藥性十分嚴(yán)重。2.雞白痢沙門(mén)菌的脂多糖的提取與鑒定通過(guò)改進(jìn)的熱酚水法提取雞白痢沙門(mén)菌的LPS,兩株雞白痢沙門(mén)菌(S6702和S44)的LPS產(chǎn)率分別是4.3%和3.6%;LPS純化后其中的核酸含量分別為0.011%和0.011%;蛋白含量分別為0.39%和0.49%;多糖含量分別為18.3%和16.5%。將提取的雞白痢沙門(mén)菌LPS進(jìn)行SDS-PAGE電泳及銀染,結(jié)果顯示雞白痢沙門(mén)菌S44和S6702的LPS表型均呈現(xiàn)梯狀結(jié)構(gòu),為光滑型LPS。因此,可用于檢測(cè)方法的建立。3.雞白痢抗體間接ELISA方法的建立使用上述方法提取的LPS建立間接ELISA雞白痢抗體檢測(cè)方法。對(duì)間接ELISA的最佳反應(yīng)條件進(jìn)行摸索,確定其抗原包被濃度為1.25μg/mL,待檢血清最適稀釋度為1:800,最適封閉液為5%山羊血清,酶標(biāo)抗體的最適工作濃度為1:16000,血清反應(yīng)的最佳時(shí)間為60 min,顯色液反應(yīng)時(shí)間為15 min。由S6702的LPS建立的間接ELISA陰陽(yáng)性O(shè)D450nm臨界值為0.269。用該間接ELISA檢測(cè)方法對(duì)變形桿菌、普羅威登斯菌、巴氏桿菌、大腸桿菌、綠膿桿菌和鼠傷寒等常見(jiàn)病原感染雞的陽(yáng)性血清進(jìn)行檢測(cè),結(jié)果均呈現(xiàn)陰性,表明該方法具有良好的特異性;檢測(cè)陽(yáng)性血清時(shí)玻板凝集試驗(yàn)效價(jià)為1:64,該ELISA檢測(cè)效價(jià)為1:12800,具有更高的敏感性。廣譜性和重復(fù)性試驗(yàn)結(jié)果表明,該方法可檢測(cè)不同雞白痢沙門(mén)菌高免血清,批間和批內(nèi)重復(fù)性好。對(duì)100份臨床血清進(jìn)行檢測(cè),該ELISA方法與玻板凝集試驗(yàn)的符合率是89%,與進(jìn)口 ELISA檢測(cè)試劑盒的符合率是93%。綜上,2017-2018年華東地區(qū)沙門(mén)菌的多種耐藥現(xiàn)象嚴(yán)重;基于LPS的間接ELISA雞白痢檢測(cè)方法特異性好,敏感性高。因此,該檢測(cè)方法適用于臨床雞群雞白痢抗體水平檢測(cè),可為雞白痢凈化工作提供技術(shù)支持。
【學(xué)位授予單位】：揚(yáng)州大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2019
【分類(lèi)號(hào)】：S852.61
【圖文】：

單個(gè)菌落接種于５ｍＬＬＢ液體培養(yǎng)基中，３７°Ｃ培養(yǎng)１６？１８ｈ后，用１５％甘油液，使其0Ｄ６ｅＱｎｎｉ值為０．１。將稀釋后的菌液用滅菌棉簽均勻涂布于ＬＢ瓊脂塊板子上貼６個(gè)藥敏紙片，３７°Ｃ培養(yǎng)１６？１８邋ｈ后量取抑菌圈直徑，重復(fù)３次，分析其耐藥率及多重耐藥性逡逑３結(jié)果逡逑３．１沙門(mén)菌的分離培養(yǎng)結(jié)果逡逑沙門(mén)菌在麥康凱培養(yǎng)基上生長(zhǎng)為無(wú)色至淺橙色、透明或半透明，菌落中心在沙門(mén)菌屬顯色培養(yǎng)基上呈紫紅色或紫羅蘭色、扁平透明的菌落。革蘭氏染端鈍圓的短桿菌，無(wú)莢膜和芽孢。逡逑３．２沙門(mén)菌的多重ＰＣＲ的鑒定逡逑經(jīng)ｍＰＣＲ鑒定，從２０１７年－２０１８年共分離鑒定７１株沙門(mén)菌，其中鼠傷寒雞白痢沙門(mén)菌２５株，腸炎沙門(mén)菌１０株，３株其它沙門(mén)菌。所有沙門(mén)菌屬均可的屬特異性條帶。其中，鼠傷寒沙門(mén)菌可另外擴(kuò)增出４０１邋ｂｐ的型特異性條帶，菌可另外擴(kuò)增出大小為２５２邋ｂｐ的型特異性條帶，腸炎沙門(mén)菌可另外擴(kuò)增出大的型特異性條帶，具體見(jiàn)圖１小逡逑

０１８年華東地區(qū)禽沙門(mén)菌的流調(diào)及雞白痢沙門(mén)菌ＬＰＳ間接ＥＬＩＳＡ２００邋ｍＬ邋３０％去離子水，搖床上室溫震搖１０邋ｍｉｎ；棄掉去震搖２邋ｍｉｎ進(jìn)行增敏，棄去銀染增敏液，去離子水洗滌水，加入１００邋ｍＬ銀溶液，室溫震搖１０邋ｍｉｎ銀染；棄去銀溶震搖１－１．５邋ｍｉｎ；棄掉去離子水，加入１００邋ｍＬ銀染顯色液，ＬＰＳ條帶。逡逑定，Ｓ６７０２雞白痢沙門(mén)菌樣品和Ｓ４４雞白痢沙門(mén)菌樣品沙門(mén)菌特異性條帶，表明二者確為雞白痢沙門(mén)菌。結(jié)果

逑３＿２．２邋ＬＰＳ蛋白含置測(cè)定逡逑經(jīng)分光光度計(jì)得到ＢＣＡ標(biāo)準(zhǔn)曲線（圖２－１），從標(biāo)準(zhǔn)曲線得出其蛋白含量與吸光度關(guān)逡逑系式為：ｙ＝０．８９１２ｘ－０．１２４９，將ＬＰＳ進(jìn)行梯度稀釋?zhuān)顾鶞y(cè)ＯＤ５９５ｎｍ在標(biāo)準(zhǔn)曲線范圍內(nèi)，將逡逑平均值帶入方程，得出Ｓ６７０２蛋白濃度為０．０４９ｍｇ／ｍＬ，純化后的ＬＰＳ中的Ｓ６７０２蛋白含逡逑量為０．３９％。Ｓ４４蛋白濃度為０．０５６邋ｍｇ／ｍＬ，純化后的ＬＰＳ中的Ｓ４４蛋白含量為０．４９％。逡逑標(biāo)準(zhǔn)蛋白濃度曲線逡逑０．４５－逡逑°４－逡逑０．３Ｓ－邐？？？？？逡逑０邐３－邐．．．？＊＊＊＊邋ｙ邋－邋０．３＊１６３ｘ邋＋邋０．０５０８逡逑Ｉ邋０．２５－邐？？？？，？？？邐Ｒ２邋＝邋０．９９８１逡逑０．１－邋？？？？？逡逑０．０５－逡逑０邐０．２邐０．４邐０．６邐０．８邐１邐１．２逡逑蛋白濃度（ｍｇ／ｍＬ）逡逑圖２－１邋ＢＳＡ標(biāo)準(zhǔn)曲線逡逑Ｆｉｇｕｒｅ２－１邋Ｓｔａｎｄａｒｄ邋ｃｕｒｖｅ邋ｏｆ邋ＢＳＡ逡逑３．２．３邋ＬＰＳ多糖含量測(cè)定逡逑采用苯酚－硫酸法測(cè)定ＬＰＳ多糖含量，經(jīng)分光光度計(jì)得到葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線（圖２－２），逡逑從標(biāo)準(zhǔn)曲線得出其多糖含量與吸光度關(guān)系式為：ｙ＝０．５８８４＞ｃ＋０．０９８１，將ＬＰＳ進(jìn)行梯度稀釋?zhuān)义鲜顾鶞y(cè)0Ｄ５９５ｎｍ在標(biāo)準(zhǔn)曲線范圍內(nèi)，將平均值帶入方程，得出Ｓ６７０２多糖濃度為２．２５邋ｍｇ／ｍＬ，逡逑純化后的ＬＰＳ中的Ｓ６７０２多糖含量為１８．３％？邋Ｓ４４多糖濃度為１．８６邋ｍｇ／ｍＬ

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本文編號(hào)：2803738