【摘要】：綿羊肺炎支原體(Mo)是羊支原體肺炎的主要病原,以3月齡山羊和綿羊最為易感,患羊肺部發(fā)生纖維素性滲出炎癥為主要特征。不同品種羊?qū)ρ蛑гw肺炎易感性存在差異,分析認為與不同品種羊免疫反應存在相關關系。Toll樣受體(TLRs)是機體重要的免疫相關分子,主要分布于上皮細胞、免疫細胞等,通過識別病原相關分子模式,將信號沿著MyD88途徑或TRIF途徑進行傳遞,調(diào)控NF-?B、AP-1等分子轉(zhuǎn)錄,最終啟動免疫細胞增殖和炎性細胞因子表達,幫助機體抵御和清除病原體。然而不可控的炎癥反應,將會造成機體組織損傷。本研究在分析不同種羊(黑山羊、白山羊、麻羊、波爾山羊和湖羊)Toll樣受體基因及表達多態(tài)性基礎上,通過Mo人工感染5種羊,以典型病變組織樣本肺臟和全身性炎癥樣本血液為研究對象,采用TaqMan實時熒光定量PCR方法,從TLR1-10基因含量水平、TLR1-10基因轉(zhuǎn)錄水平、MyD88和TRIF信號通路重要接頭分子轉(zhuǎn)錄水平探討不同品種羊感染Mo后,Toll樣受體及其通路因子表達差異性,為研究Toll樣受體與支原體肺炎易感性關系奠定基礎性研究資料。1.Mo感染不同品種羊TLRs基因水平差異性研究5種實驗羊進行Mo人工感染顯示不同品種羊Mo感染后病程、死亡率和炎癥水平存在差異,其中死亡率從高到低依次為白山羊、黑山羊、麻羊、波爾山羊和湖羊,其中湖羊和各對照組均無死亡。采集實驗組血液樣本122份、肺臟樣本25份進行TLR1-10基因定量檢測與分析。實驗羊肺臟樣本TLRs基因定量檢測分析顯示,同種羊感染組肺組織中TLR2/4/5/6/8/9基因含量顯著高于對照組(P0.05),而TLR3/7/10感染組與對照組差異不顯著(P0.05);各品種羊感染組肺組織中TLR1基因含量與對照組相比存在種間差異。種內(nèi)比較結果提示TLRs參與Mo感染過程,且存在種間差異。不同種羊感染組肺組織中TLR1-10基因含量差異性分析顯示,白山羊肺組織中TLR2基因含量極顯著高于黑山羊、麻羊、波爾山羊和湖羊(P0.01),黑山羊TLR10基因含量極顯著高于白山羊、麻羊、波爾山羊和湖羊(P0.01),黑山羊、白山羊TLR6和TLR8基因含量極顯著高于麻羊、波爾山羊和湖羊(P0.01),麻羊、波爾山羊TLR4/5基因和湖羊TLR5基因含量極顯著高于白山羊和黑山羊(P0.01)。種間比較結果提示TLR2/4/6/8可能參與黑山羊、白山羊、麻羊感染早期炎癥的快速發(fā)展并導致死亡。不同種羊血液樣本TLRs基因定量檢測分析顯示,同種羊不同時段血液樣本中感染組TLR1/2/4/6/10含量高于對照組,感染組TLR3/9含量與對照組、感染組不同時段并無顯著性差異;黑山羊TLR5、湖羊TLR7在感染組與對照組之間無明顯差異。種內(nèi)比較提示,TLRs能參與全身炎癥的發(fā)生發(fā)展,不同品種羊在TLR5/7/8存在差異。5種羊TLR1/2/4/5/6在感染0 h無顯著性差異(P0.05),麻羊、波爾山羊和湖羊感染48 h和96 h血液樣本TLR1基因含量顯著高于黑山羊和白山羊(P0.01);黑山羊和白山羊48和96 h血液TLR2基因、黑山羊和白山羊96 h血液TLR4基因含量極顯著高于麻羊、波爾山羊和湖羊(P0.01);白山羊和波爾山羊96 h血液TLR6基因極顯著高于黑山羊、麻羊和湖羊。血液樣本分析結果提示TLR1/2/4/6參與各品種羊全身性炎癥過程,其中TLR1水平可能與實驗羊血液炎癥發(fā)生呈負相關,而TLR2/4/6與炎癥發(fā)展呈正相關。2.Mo感染不同品種羊TLRs轉(zhuǎn)錄水平差異性研究應用TaqMan實時熒光定量檢測方法對5種羊25份肺臟樣本和126份血液樣本TLR1-10轉(zhuǎn)錄水平檢測分析。實驗羊肺臟樣本中TLRs基因轉(zhuǎn)錄水平分析顯示,各種羊感染組肺臟組織中TLRs基因轉(zhuǎn)錄水平均顯著高于對照組(P0.05)。黑山羊、白山羊肺組織中TLR1/2/4/5/6/8/9基因轉(zhuǎn)錄水平高于TLR3/7/10,而麻羊、波爾山羊、湖羊肺組織中TLR4/5/7/8基因轉(zhuǎn)錄水平高于TLR1/2/3/6/9/10。種內(nèi)比較結果提示,TLRs轉(zhuǎn)錄水平與基因含量水平呈現(xiàn)相似結果,與炎癥進程存在相關關系。不同種羊肺臟樣本TLRs基因轉(zhuǎn)錄水平分析顯示,黑山羊、白山羊肺組織中TLR1/2/9轉(zhuǎn)錄水平顯著高于麻羊、波爾山羊和湖羊(P0.05),白山羊肺組織中TLR6、湖羊肺組織中TLR4轉(zhuǎn)錄水平較其它品種羊最高(P0.01);波爾山羊肺組織TLR5/7/10轉(zhuǎn)錄水平最高(P0.01)。種間比較結果提示,TLRs轉(zhuǎn)錄水平參與調(diào)控羊支原體炎癥進程存在種間差異。實驗羊血液樣本中TLR1-10轉(zhuǎn)錄水平分析顯示,同種羊感染Mo 48 h和96 h血液樣本TLR1/2/4/6/7/8基因轉(zhuǎn)錄水平高于0 h和對照組;麻羊、波爾山羊、湖羊感染組TLR3基因轉(zhuǎn)錄水平高于對照組;麻羊感染組TLR10轉(zhuǎn)錄水平顯著高于對照組。種內(nèi)比較結果,提示各品種TLR1/2/4/6/7/8普遍參與全身性炎癥反應,而TLR3/5/9/10存在種間差異。各種羊感染組間各時段TLR5/9無顯著差異;0 h、48 h感染組血液樣本TLR1基因轉(zhuǎn)錄水平種間差異不顯著(P0.05),湖羊96 h血液中TLR1轉(zhuǎn)錄水平顯著高于其余品種羊(P0.05);黑山羊、白山羊、波爾山羊和湖羊感染組48 h、96 h時TLR4轉(zhuǎn)錄水平極顯著高于麻羊(P0.01);白山羊感染組48 h和96 h時TLR6轉(zhuǎn)錄水平極顯著高于其余4種羊(P0.01);白山羊、波爾山羊感染組不同時間TLR7基因轉(zhuǎn)錄水平均極顯著高于黑山羊、麻羊和湖羊;白山羊和黑山羊感染組48 h和96 h時TLR8基因轉(zhuǎn)錄水平極顯著高于麻羊、波爾山羊和湖羊。種間比較結果提示TLR1在轉(zhuǎn)錄水平負調(diào)控炎癥進程,TLR2/4/6/7/8轉(zhuǎn)錄參與調(diào)控炎癥進程存在種間差異。3.Mo感染不同品種羊TLRs MyD88通路因子轉(zhuǎn)錄水平差異性研究應用TaqMan實時熒光定量檢測方法對5種羊25份肺臟樣本和126份血液樣本進行TLRs MyD88通路因子轉(zhuǎn)錄水平檢測分析。結果顯示,5種羊感染組肺組織MyD88、TRAF6、NF-кB、FOS、JUN基因轉(zhuǎn)錄水平均極顯著高于對照組(P0.01);種間差異性分析顯示,白山羊肺組織NF-кB基因轉(zhuǎn)錄水平極顯著高于其余4種羊(P0.01);黑山羊、白山羊肺組織FOS基因轉(zhuǎn)錄水平極顯著高于麻羊、波爾山羊和湖羊(P0.01);JUN基因轉(zhuǎn)錄水平種間差異不顯著(P0.05)。實驗羊肺組織MyD88通路因子轉(zhuǎn)錄水平差異性分析提示,Mo感染可激活TLRs MyD88通路促進炎癥反應,其中白山羊、黑山羊反應強烈。血液樣本MyD88、TRAF6、NF-кB、FOS、JUN基因轉(zhuǎn)錄水平差異性分析顯示,5種羊感染組極顯著高于對照組(P0.01),同時感染48、96 h各基因轉(zhuǎn)錄水平均高于0 h。黑山羊和白山羊感染組各時段MyD88、TRAF6、FOS轉(zhuǎn)錄水平均極顯著高于麻羊、波爾山羊和湖羊(P0.01)。5種羊感染組NF-кB基因轉(zhuǎn)錄水平0 h-96 h間持續(xù)升高,種間無顯著性差異(P0.05);5種羊感染組JUN基因各時段均差異不顯著(P0.01)。血液樣本MyD88通路因子轉(zhuǎn)錄水平差異性分析提示,Mo感染可激活TLRs MyD88通路促進炎癥反應,5種羊TLRs/MyD88/NF-кB通路存在差異,以黑山羊、白山羊表現(xiàn)更為強烈。4.Mo感染不同品種羊TLRs TRIF通路因子轉(zhuǎn)錄水平差異性研究應用TaqMan實時熒光定量檢測方法對5種羊25份肺臟樣本和126份血液樣本TLRs TRIF通路因子轉(zhuǎn)錄水平檢測分析顯示,5種羊感染組肺組織中TRIF、TRAF3、IRF3、IRF7極顯著高于對照組(P0.01);種間差異性分析顯示,TRIF、TRAF3基因種間彼此差異顯著(P0.05),麻羊肺組織IRF3基因轉(zhuǎn)錄水平最高(P0.01);黑山羊、白山羊肺組織IRF7轉(zhuǎn)錄水平極顯著高于麻羊、波爾山羊和湖羊(P0.01)。TRIF通路因子轉(zhuǎn)錄水平差異性分析提示,Mo感染可啟動羊TLRs TRIF信號通路,其中以黑山羊、白山羊最為明顯。5種羊感染組血液樣本TRIF、IRF3、IRF7基因轉(zhuǎn)錄水平極顯著高于對照組(P0.01),且感染48 h和96 h時轉(zhuǎn)錄水平均高于0 h;種間差異性分析顯示,黑山羊、白山羊感染組96 h時TRIF基因轉(zhuǎn)錄水平極顯著高于麻羊、波爾山羊、湖羊(P0.01);麻羊感染組48 h和96 h時IRF3基因轉(zhuǎn)錄水平極顯著高于黑山羊、白山羊、波爾山羊和湖羊(P0.01);黑山羊、白山羊感染組48 h、96 h時IRF7轉(zhuǎn)錄水平極顯著高于麻羊、波爾山羊和湖羊。血液樣本TRIF通路因子轉(zhuǎn)錄水平差異性分析提示,Mo感染激活TLRs TRIF通路,黑山羊、白山羊表現(xiàn)強烈。
【學位授予單位】：貴州大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2019
【分類號】：S858.26;S858.27
【圖文】：

設計的 TLR1-10 基因的引物能從羊 DNA段大小相符。因重組質(zhì)粒 PCR 鑒定結果 TLR1-10 基因和β-actin 內(nèi)參基因重組質(zhì)粒為模 2.2.2.1 的反應體系對重組質(zhì)粒進行 PCR 鑒定，10M 1 2 3 45 6 7 8 9 11圖 1-1 目的基因 PCR 擴增結果00 Marker ;1:TLR1;2:TLR2;3:TLR3;4:TLR4;5:TLR5;6:TLR68:TLR8;9:TLR9;10:TLR10;11:β-actinFig.1-1 PCR Amplification of target gene0 Marker ;1TLR1;2:TLR2;3:TLR3;4:TLR4;5:TLR5;6:TLR6;8:TLR8;9:TLR9;10:TLR10;11:β-actin500 bp100 bp151131250 bp

設計的 TLR1-10 基因的引物能從羊 DNA大小相符。組質(zhì)粒 PCR 鑒定結果LR1-10 基因和β-actin 內(nèi)參基因重組質(zhì)粒為模2.2.1 的反應體系對重組質(zhì)粒進行 PCR 鑒定，10ppM 1 2 3 41985 6 7 8 9 11圖 1-1 目的基因 PCR 擴增結果arker ;1:TLR1;2:TLR2;3:TLR3;4:TLR4;5:TLR5;6:TLR68:TLR8;9:TLR9;10:TLR10;11:β-actinFig.1-1 PCR Amplification of target genearker ;1TLR1;2:TLR2;3:TLR3;4:TLR4;5:TLR5;6:TLR6;8:TLR8;9:TLR9;10:TLR10;11:β-actin

表 1-4 羊 TLR1-10 和β-actin 標準曲線基本信息Table.1-4 The basic information of TLR1-10 and β-actin standard curve基因名稱Genes擴增效率%E Values相關系數(shù)R2Values斜率SopeY 軸截距Y-Axis線性方程Linear equationTLR1 103 1 -3.28 44.98 Ct=-3.28lnX+44.98Number 1-7:TLR1-10 gene recombinant plasmid diluted from 1.0×109copies/μL-1.0×103copies/μL;圖 1-3 羊 TLRs 基因 qPCR 擴增曲線（A）和回歸曲線（B）ig.1-3 The result of qPCR amplification of curve（A）and regression curve（B）of sheep TLRs gene1 2 3 4 5 6 7A7654321BNumber 1-7:β-actin gene recombinant plasmid diluted from 1.0×109copies/μL-1.0×103copies/μL;圖 1-4 羊β-actin 基因 qPCR 擴增曲線（A）和回歸曲線（B）Fig.1-4 The result of qPCR amplification of curve（A）and regression curve（B）of sheep β-actin gene

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本文編號：2800143