【摘要】：豬傳染性胃腸炎(transmissible gastroenteritis,TGE)是由豬傳染性胃腸炎病毒(transmissible gastroenteritis virus,TGEV)引起的一種急性、接觸性傳染病,TGEV可引起仔豬腸黏膜上皮細胞(intestinal epithelial cell,IPEC)發(fā)生變性、死亡,造成腸管水、電解質(zhì)代謝紊亂,營養(yǎng)吸收障礙,從而引起仔豬腹瀉、脫水、營養(yǎng)流失,甚至死亡。非編碼RNA(non-coding RNA,ncRNA)包括微小RNA(microRNA,miRNA)、環(huán)狀RNA(circular RNA,circRNA)、長鏈非編碼RNA(long non-coding RNA,lncRNA)等,在細胞新陳代謝、線粒體損傷以及病毒感染等生理和病理過程中發(fā)揮重要調(diào)控作用。線粒體是維持細胞正常代謝以及營養(yǎng)吸收功能的關鍵細胞器之一,前期研究發(fā)現(xiàn),TGEV感染可誘導豬腎細胞PK-15(porcine kidney cell PK-15,PK-15)線粒體腫脹、破裂、功能異常。然而,TGEV是否同樣可以誘導IPEC-J2細胞線粒體損傷,以及在此過程中miRNA和circRNA表達譜的變化情況及調(diào)控機制至今尚未見報道。本論文首先建立TGEV感染豬空腸黏膜上皮細胞(intestinal porcine epithelial cell-jejunum 2,IPEC-J2)誘導細胞線粒體損傷模型,然后采用RNA測序(RNA sequencing,RNA-seq)技術檢測TGEV感染后IPEC-J2細胞miRNA和circRNA表達譜的變化,預測、篩選與線粒體相關的miRNA和circRNA。最后利用實時定量PCR(quantitative real time polymerase chain reaction,qRT-PCR)、熒光原位雜交(fluorescence in situ hybridization,FISH)、免疫印跡(western blot,WB)、雙熒光素酶報告基因(dual luciferase reporter,DLR)分析、流式細胞術(flow cytometry,FCM)等方法研究miRNA和circRNA在TGEV誘導IPEC-J2細胞線粒體損傷過程中的調(diào)控作用及機制。研究取得以下結(jié)果。1.TGEV感染新生仔豬,48 h后采集仔豬空腸組織,病理組織學檢查結(jié)果發(fā)現(xiàn),TGEV感染的仔豬空腸壁變薄,腸腔擴張,IPEC細胞變性、死亡,絨毛脫落、變短;電鏡檢查結(jié)果顯示,TGEV感染后,IPEC細胞線粒體腫脹、破裂、嵴斷裂、數(shù)量減少。1.0 MOI TGEV體外感染IPEC-J2細胞24 h,電鏡檢查發(fā)現(xiàn),IPEC-J2細胞線粒體腫脹、破裂、嵴斷裂。使用流式細胞儀、激光共聚焦顯微鏡及多功能微孔板檢測儀檢測發(fā)現(xiàn),細胞內(nèi)線粒體通透性轉(zhuǎn)換孔(mitochondrial permeability transition pore,mPTP)異常開放(p0.01);活性氧(reactive oxygen,ROS)水平升高(p0.01);線粒體膜電位(mitochondrial membrane potential,MMP)降低(p0.01)。2.利用RNA-seq技術檢測TGEV誘導IPEC-J2細胞線粒體損傷過程中miRNA表達譜的變化,篩選得到65個差異表達的miRNAs(fold change≥1.5,FDR≤0.05),其中46個miRNAs表達量上調(diào),19個miRNAs表達量下調(diào)。采用RNAhybrid(v2.1.2)+svm_light(v6.01)、Miranda(v3.3a)、TargetScan(Version:7.0)3種算法預測差異表達miRNAs的靶基因,得到3088個靶基因。對3088個靶基因進行KEGG富集分析,發(fā)現(xiàn)差異表達的miRNAs主要富集于代謝(metabolic pathways)、二次代謝產(chǎn)物的生物合成(biosynthesis of secondary metabolites)、抗生素的生物合成(biosynthesis of antibiotics)等通路中;對3088個靶基因進行GO富集分析,發(fā)現(xiàn)其中有58個miRNAs對應的286個靶基因定位于線粒體,其中known miRNAs有15個。3.利用RNA-seq技術檢測TGEV誘導IPEC-J2細胞線粒體損傷過程中circRNA表達譜的變化,篩選得到123個差異表達的circRNAs,其中69個circRNAs表達量上調(diào),54個circRNAs表達量下調(diào)(fold change≥2,FDR≤0.05)。利用Mireap(v0.2)、Miranda(v3.3a)、TargetScan(Version7.0)和StarBase數(shù)據(jù)庫,分析差異表達circRNAs與線粒體相關差異表達miRNAs種子序列結(jié)合情況,并通過差異表達circRNAs與miRNAs表達量的負相關性篩選得到與線粒體相關miRNAs存在調(diào)控關系的10個circRNAs。qRT-PCR驗證circRNAs表達量的變化,結(jié)果與RNA-seq一致。4.根據(jù)生物信息學分析結(jié)果,篩選差異表達較大、與線粒體相關的miR-22作為研究對象,研究其在TGEV誘導線粒體損傷過程中的作用機制。用miR-22 mimics和miRNA inhibitor過表達和沉默miR-22,檢測miR-22對mPTP、ROS及MMP的作用,發(fā)現(xiàn)miR-22促進TGEV誘導的IPEC-J2細胞mPTP異常開放(p0.01)、ROS積累(p0.01),降低MMP(p0.05);預測miR-22靶基因,篩選得到與線粒體相關的15個靶基因,采用雙熒光素酶試驗和WB試驗驗證miR-22靶基因,證實HK2是miR-22靶基因。用小干擾RNA(small interfering RNA,siRNA)沉默HK2,檢測mPTP異常開放情況、細胞內(nèi)ROS水平以及MMP,結(jié)果顯示,沉默HK2促進TGEV誘導的IPEC-J2細胞mPTP異常開放(p0.01)、ROS積累(p0.01)及MMP下降(p0.05)。5.根據(jù)生物信息學預測結(jié)果結(jié)合雙熒光素酶試驗驗證得到circEZH2與miR-22具有結(jié)合能力,FISH試驗發(fā)現(xiàn),circEZH2和miR-22可共同定位在細胞質(zhì)中。構(gòu)建pcircRNA-circEZH2質(zhì)粒,并設計合成circEZH2的siRNA,分別轉(zhuǎn)染IPEC-J2細胞,并感染TGEV,檢測circEZH2對mPTP的作用,發(fā)現(xiàn)circEZH2抑制TGEV誘導的IPEC-J2細胞mPTP異常開放(p0.01),ROS積累(p0.05)和MMP下降(p0.05)。為了證明circEZH2是通過吸附miR-22調(diào)控TGEV誘導的線粒體損傷過程,將pcircRNA-circEZH2和miR-22 mimics con(或pcircRNA-circEZH2和miRNA mimics con)轉(zhuǎn)染到IPEC-J2細胞,然后感染TGEV,檢測細胞mPTP異常開放情況,結(jié)果證實,miR-22能夠阻斷pcircRNA-circEZH2對TGEV誘導IPEC-J2細胞mPTP異常開放、ROS積累、MMP下降的抑制作用(p0.05)。本研究首先證實了TGEV誘導IPEC-J2細胞mPTP異常開放、ROS水平升高、MMP降低,造成線粒體腫脹、破裂、嵴斷裂,成功構(gòu)建了TGEV誘導IPEC-J2細胞線粒體損傷模型。進而通過RNA-seq技術檢測到TGEV誘導IPEC-J2細胞線粒體損傷過程中有65個miRNAs和123個circRNAs差異表達,并通過靶基因預測和生物信息學分析篩選得到了線粒體相關known miRNAs有15個,通過比對circRNA上的miRNA應答元件(microRNA response elements,MREs)結(jié)合circRNA的組成情況預測得到10個circRNAs與線粒體相關known miRNAs具有結(jié)合能力。根據(jù)生物信息學分析結(jié)果,篩選差異表達較大、與線粒體相關的miR-22作為研究對象,并通過雙熒光素酶及FISH試驗證實circEZH2與miR-22結(jié)合。最后,采用一系列實驗室手段闡明了circEZH2通過吸附miR-22促進HK2翻譯過程,抑制TGEV誘導的線粒體損傷的作用機制。研究結(jié)果為進一步揭示TGEV致病機制提供理論依據(jù)。
【學位授予單位】：西北農(nóng)林科技大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2019
【分類號】：S858.28
【圖文】：

圖 3-1 TGEV N 基因 PCR 電泳結(jié)果箭頭代表 PCR 產(chǎn)物位置（150 bp） Electrophoretic results of PCR for N genes represent the location of PCR production仔豬空腸病變片制作方法，結(jié)合 HE 染色法，制描儀觀察并記錄 TGEV 感染組及 ck 組相比，TGEV 感染的仔豬空腸圖 3-2）。

圖 3-1 TGEV N 基因 PCR 電泳結(jié)果箭頭代表 PCR 產(chǎn)物位置（150 bp）Fig. 3-1 Electrophoretic results of PCR for N gene of TGEVArrows represent the location of PCR production (150 bp)V 感染誘導仔豬空腸病變織常規(guī)石蠟切片制作方法，結(jié)合 HE 染色法，制作仔豬空腸組字病理切片掃描儀觀察并記錄 TGEV 感染組及 Mock 組空腸組顯示，與 Mock 組相比，TGEV 感染的仔豬空腸壁變薄，IPEC脫落、變短（圖 3-2）。

圖 3-3 透射電子顯微鏡結(jié)果ock 組 IPEC-J2 細胞線粒體超微結(jié)構(gòu)；B：體外試驗 TGEV 感染組C：體內(nèi)試驗 Mock 組空腸黏膜上皮細胞線粒體超微結(jié)構(gòu)；D：體膜上皮細胞線粒體超微結(jié)構(gòu)；箭頭所指為線粒體；三角所指為 TGFig. 3-3 The result of transmission electron microscopeUltrastucture of mitochondria in IPEC-J2 of Mock group in vitro; B: Ultn IPEC-J2 of TGEV infected group in vitro; C: Ultrastucture of mitocho vivo; D: Ultrastucture of mitochondria in IPEC of TGEV infected grouppoints to mitochondrion; triangle points to viral particle 誘導 IPEC-J2 細胞 mPTP 異常開放cellProbeTM M61 mPTP 檢測試劑盒檢測原理是利用熒e RecoveryAfter Photobleaching，F(xiàn)RAP）技術進行檢測。首lProbeTM M61 探針，BBcellProbeTM M61 探針是一種對活色試劑，它其實是在鈣黃綠素（Calcein）中插入了乙酰甲氧

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本文編號：2800105