【摘要】：目的:本研究選擇巴什拜羊及盤羊雜交羊為實驗動物,人工感染綿羊肺炎支原體(Mycoplasma ovipneumoniae,MO),建立綿羊支原體肺炎病例模型,應用RNA-Seq技術對其進行高通量轉錄組測序分析,篩選相關的差異表達基因(Differently Expressed Genes,DEGs),為探析巴什拜羊和盤羊雜交感染MO的分子作用機制奠定基礎。方法:(1)巴什拜羊與盤羊雜交羊對MO感染的比較:將6只巴什拜羊和6只盤羊雜交羊人工感染MO,分別觀察其臨床癥狀和病理解剖變化,用ELISA方法分別檢測血清中IL-1β、IL-6、IL-9及IFN-γ的濃度,制作肺部組織切片,觀察組織病理學變化,并用支原體肺炎動物模型的組織病理學評分系統(tǒng)進行組織病理學評分。(2)綿羊支原體肺炎病例模型的建立:巴什拜羔羊和盤羊雜交羔羊各9只,年齡2月,體重15-20kg,MO ELISA診斷試劑盒檢測MO抗體均為陰性,用MO濃度約為CCU=10~6/mL,2 mL/只的劑量感染兩種實驗羊,每天記錄觀察臨床表現并測量體溫。采集感染MO后4d、14d實驗羊的血液,分離血清,用MO ELISA診斷試劑盒再次檢測MO抗體。(3)巴什拜羊,盤羊雜交羊肺組織轉錄組學研究:分別屠宰0d、MO感染4d、14d的巴什拜羊和盤羊雜交羊,設置3個生物學重復,迅速采集其肺組織,液氮保存送回實驗室,提取RNA。使用IlluminaHiSeq~(TM) 2500平臺進行高通量測序,P值0.05且Foldchange值2或0.667標準篩選差異表達基因、用GOseq R軟件包進行Gene ontology(GO)富集分析和用KOBAS軟件Kyoto encyclopoedia of genes and genomes(KEGG)富集分析。最后,再應用熒光定量PCR進行驗證轉錄組測序結果。(1)通過以上方法對巴什拜羊感染MO前后進行轉錄組分析;(2)通過以上方法對盤羊雜交羊感染MO前后進行轉錄組分析;(3)以盤羊雜交羊為對照,巴什拜羊為實驗組,通過以上方法對兩種羊不同時間點肺組織進行比較轉錄組分析。結果(1)結果發(fā)現,感染后雜交羊比巴什拜羊表現出更嚴重的、典型的支原體肺炎的臨床癥狀和病理解剖變化。組織病理學評分結果顯示,雜交羊顯著高于巴什拜羊。相關細胞因子檢測結果發(fā)現,雜交羊的血清中IL-1β、IL-6、IL-9及IFN-γ的濃度均顯著高于巴什拜羊。這說明巴什拜羊對MO感染具有一定的抗性,而雜交羊對MO較易感。(2)建立綿羊支原體肺炎病例模型的結果:巴什拜羊體溫一過性升高,而盤羊雜交羊的體溫則呈長時間較高幅度的升高。盤羊雜交羊在臨床癥狀和病理解剖變化上表現出更典型,更嚴重的支原體肺炎的現象。在感染MO后所有實驗羊的血清用MO ELISA診斷試劑盒檢測MO抗體均為陽性。說明成功的建立了綿羊支原體肺炎病例。(3)轉錄組學分析結果。(1)巴什拜羊差異表達基因結果表明:巴什拜羊感染MO 4dpi和14dpi與0d相比較DEGs分別有1048個(上調575個,下調473個)和2823個(上調1362個,下調1461個);KEGG分析發(fā)現4dpi和14dpi與0d相比較的DEGs分別富集到245和287條通路中,其中與MO感染最密切相關的通路是TLR信號通路中(p=2.39 E-17),從富集到該通路圖中的DEGs分布可以得出2條傳導途徑:第一條:MO LAMP-TLR2/TLR6-MyD88-MKK6-AP1-IL1B;第二條:MO LAMP-TLR8-MyD88-IRF5-RANTES。GO分析發(fā)現4dpi和14dpi與0d相比較的DEGs分別富集到1580和4561個條目中,經p值篩選發(fā)現其中與MO感染最密切相關的GO條目功能描述為積極調節(jié)炎癥反應(p=1.27E-07)。(2)盤羊雜交羊差異表達基因結果表明:盤羊雜交羊感染MO 4dpi和14dpi與0d相比較DEGs分別有156個(上調44,下調112)和367個(上調35,下調332)。KEGG分析發(fā)現4dpi和14dpi與0d相比較的DEGs分別富集到109和150條通路中,其中與MO感染最密切相關的通路是免疫缺陷(p=2.98E-09)信號通路。GO分析發(fā)現4dpi和14dpi與0d相比較的DEGs分別富集到497和928個條目中,經p值篩選發(fā)現與MO感染最密切相關的GO條目功能描述為纖毛運動受損(p=1.72E-19),富集到該條目的DEGs包括:DNAH11、DNAI2、CFAP221、HYDIN和FOXJ1。(3)巴什拜羊和盤羊雜交羊差異表達基因結果表明:感染MO 4dpi和14dpi巴什拜羊與雜交羊相比較DEGs分別有212個(上調146,下調66)和311個(上調158,下調153)。結合GO和KEGG分析,我們發(fā)現在感染的肺組織的轉錄組數據中存在幾個與MO感染相關的有意思的DEGs,包括SPLUC1(BPIFA1)、SP-A(SFTPA-1)、P2X7R、DQA、SOSC1、HO-1(HSP32)、NF-κB、NF-E2、AID、CD19和BAFFR。結論:本研究篩選出11個差異表達基因和相關信號通路將為分析巴什拜羊和盤羊雜交感染MO的分子作用機制奠定了基礎。
【學位授予單位】：石河子大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2018
【分類號】：S858.26
【圖文】：

肺臟組織病理學觀察結果，A 組巴什拜羊表現為輕度病變，肺組織結構清晰，野肺間質增寬，其間有淋巴細胞、巨噬細胞及淡粉色滲出液浸潤。細支氣管上皮排則，管腔的周圍有少量炎癥細胞浸潤（圖 1-2A）。B 組雜交羊均表現重度病變，其圍廣泛，大部分視野可見肺間質明顯變寬，壓迫肺間質致使連成片，肺泡腔消失，有大量淋巴細胞浸潤，細支氣管上皮破壞，脫落，管腔內有明顯滲出，肺間質毛細支氣管旁小靜脈淤血突出（圖 1-2B）。對兩個組綿羊肺部組織病理學評分，結果 A 分為 9.4，B 組平均分 19.9，B 組評分顯著高于 A 組（P<0.05）。

肺臟組織病理學觀察結果，A 組巴什拜羊表現為輕度病變，肺組織結構清晰，野肺間質增寬，其間有淋巴細胞、巨噬細胞及淡粉色滲出液浸潤。細支氣管上皮排則，管腔的周圍有少量炎癥細胞浸潤（圖 1-2A）。B 組雜交羊均表現重度病變，其圍廣泛，大部分視野可見肺間質明顯變寬，壓迫肺間質致使連成片，肺泡腔消失，有大量淋巴細胞浸潤，細支氣管上皮破壞，脫落，管腔內有明顯滲出，肺間質毛細支氣管旁小靜脈淤血突出（圖 1-2B）。對兩個組綿羊肺部組織病理學評分，結果 A 分為 9.4，B 組平均分 19.9，B 組評分顯著高于 A 組（P<0.05）。

圖 1-1B 嚴重的肉變、肝變、出血點和出血斑Fig1B. serious change of meat , liverdegeneration, hemorrhage points and bleedingspots圖 1-1A 肺部表面有輕微出血點Fig1A. The lungs surface of minor bleedingspots肺臟組織病理學觀察結果，A 組巴什拜羊表現為輕度病變，肺組織結構清晰，局野肺間質增寬，其間有淋巴細胞、巨噬細胞及淡粉色滲出液浸潤。細支氣管上皮排列則，管腔的周圍有少量炎癥細胞浸潤（圖 1-2A）。B 組雜交羊均表現重度病變，其病圍廣泛，大部分視野可見肺間質明顯變寬，壓迫肺間質致使連成片，肺泡腔消失，間有大量淋巴細胞浸潤，細支氣管上皮破壞，脫落，管腔內有明顯滲出，肺間質毛細血支氣管旁小靜脈淤血突出（圖 1-2B）。對兩個組綿羊肺部組織病理學評分，結果 A 組分為 9.4，B 組平均分 19.9，B 組評分顯著高于 A 組（P<0.05）。

【參考文獻】

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本文編號：2800045