發(fā)布時(shí)間：2020-08-22 00:36

【摘要】：目的:本研究選擇巴什拜羊及盤羊雜交羊?yàn)閷?shí)驗(yàn)動(dòng)物,人工感染綿羊肺炎支原體(Mycoplasma ovipneumoniae,MO),建立綿羊支原體肺炎病例模型,應(yīng)用RNA-Seq技術(shù)對(duì)其進(jìn)行高通量轉(zhuǎn)錄組測(cè)序分析,篩選相關(guān)的差異表達(dá)基因(Differently Expressed Genes,DEGs),為探析巴什拜羊和盤羊雜交感染MO的分子作用機(jī)制奠定基礎(chǔ)。方法:(1)巴什拜羊與盤羊雜交羊?qū)O感染的比較:將6只巴什拜羊和6只盤羊雜交羊人工感染MO,分別觀察其臨床癥狀和病理解剖變化,用ELISA方法分別檢測(cè)血清中IL-1β、IL-6、IL-9及IFN-γ的濃度,制作肺部組織切片,觀察組織病理學(xué)變化,并用支原體肺炎動(dòng)物模型的組織病理學(xué)評(píng)分系統(tǒng)進(jìn)行組織病理學(xué)評(píng)分。(2)綿羊支原體肺炎病例模型的建立:巴什拜羔羊和盤羊雜交羔羊各9只,年齡2月,體重15-20kg,MO ELISA診斷試劑盒檢測(cè)MO抗體均為陰性,用MO濃度約為CCU=10~6/mL,2 mL/只的劑量感染兩種實(shí)驗(yàn)羊,每天記錄觀察臨床表現(xiàn)并測(cè)量體溫。采集感染MO后4d、14d實(shí)驗(yàn)羊的血液,分離血清,用MO ELISA診斷試劑盒再次檢測(cè)MO抗體。(3)巴什拜羊,盤羊雜交羊肺組織轉(zhuǎn)錄組學(xué)研究:分別屠宰0d、MO感染4d、14d的巴什拜羊和盤羊雜交羊,設(shè)置3個(gè)生物學(xué)重復(fù),迅速采集其肺組織,液氮保存送回實(shí)驗(yàn)室,提取RNA。使用IlluminaHiSeq~(TM) 2500平臺(tái)進(jìn)行高通量測(cè)序,P值0.05且Foldchange值2或0.667標(biāo)準(zhǔn)篩選差異表達(dá)基因、用GOseq R軟件包進(jìn)行Gene ontology(GO)富集分析和用KOBAS軟件Kyoto encyclopoedia of genes and genomes(KEGG)富集分析。最后,再應(yīng)用熒光定量PCR進(jìn)行驗(yàn)證轉(zhuǎn)錄組測(cè)序結(jié)果。(1)通過(guò)以上方法對(duì)巴什拜羊感染MO前后進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組分析;(2)通過(guò)以上方法對(duì)盤羊雜交羊感染MO前后進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組分析;(3)以盤羊雜交羊?yàn)閷?duì)照,巴什拜羊?yàn)閷?shí)驗(yàn)組,通過(guò)以上方法對(duì)兩種羊不同時(shí)間點(diǎn)肺組織進(jìn)行比較轉(zhuǎn)錄組分析。結(jié)果(1)結(jié)果發(fā)現(xiàn),感染后雜交羊比巴什拜羊表現(xiàn)出更嚴(yán)重的、典型的支原體肺炎的臨床癥狀和病理解剖變化。組織病理學(xué)評(píng)分結(jié)果顯示,雜交羊顯著高于巴什拜羊。相關(guān)細(xì)胞因子檢測(cè)結(jié)果發(fā)現(xiàn),雜交羊的血清中IL-1β、IL-6、IL-9及IFN-γ的濃度均顯著高于巴什拜羊。這說(shuō)明巴什拜羊?qū)O感染具有一定的抗性,而雜交羊?qū)O較易感。(2)建立綿羊支原體肺炎病例模型的結(jié)果:巴什拜羊體溫一過(guò)性升高,而盤羊雜交羊的體溫則呈長(zhǎng)時(shí)間較高幅度的升高。盤羊雜交羊在臨床癥狀和病理解剖變化上表現(xiàn)出更典型,更嚴(yán)重的支原體肺炎的現(xiàn)象。在感染MO后所有實(shí)驗(yàn)羊的血清用MO ELISA診斷試劑盒檢測(cè)MO抗體均為陽(yáng)性。說(shuō)明成功的建立了綿羊支原體肺炎病例。(3)轉(zhuǎn)錄組學(xué)分析結(jié)果。(1)巴什拜羊差異表達(dá)基因結(jié)果表明:巴什拜羊感染MO 4dpi和14dpi與0d相比較DEGs分別有1048個(gè)(上調(diào)575個(gè),下調(diào)473個(gè))和2823個(gè)(上調(diào)1362個(gè),下調(diào)1461個(gè));KEGG分析發(fā)現(xiàn)4dpi和14dpi與0d相比較的DEGs分別富集到245和287條通路中,其中與MO感染最密切相關(guān)的通路是TLR信號(hào)通路中(p=2.39 E-17),從富集到該通路圖中的DEGs分布可以得出2條傳導(dǎo)途徑:第一條:MO LAMP-TLR2/TLR6-MyD88-MKK6-AP1-IL1B;第二條:MO LAMP-TLR8-MyD88-IRF5-RANTES。GO分析發(fā)現(xiàn)4dpi和14dpi與0d相比較的DEGs分別富集到1580和4561個(gè)條目中,經(jīng)p值篩選發(fā)現(xiàn)其中與MO感染最密切相關(guān)的GO條目功能描述為積極調(diào)節(jié)炎癥反應(yīng)(p=1.27E-07)。(2)盤羊雜交羊差異表達(dá)基因結(jié)果表明:盤羊雜交羊感染MO 4dpi和14dpi與0d相比較DEGs分別有156個(gè)(上調(diào)44,下調(diào)112)和367個(gè)(上調(diào)35,下調(diào)332)。KEGG分析發(fā)現(xiàn)4dpi和14dpi與0d相比較的DEGs分別富集到109和150條通路中,其中與MO感染最密切相關(guān)的通路是免疫缺陷(p=2.98E-09)信號(hào)通路。GO分析發(fā)現(xiàn)4dpi和14dpi與0d相比較的DEGs分別富集到497和928個(gè)條目中,經(jīng)p值篩選發(fā)現(xiàn)與MO感染最密切相關(guān)的GO條目功能描述為纖毛運(yùn)動(dòng)受損(p=1.72E-19),富集到該條目的DEGs包括:DNAH11、DNAI2、CFAP221、HYDIN和FOXJ1。(3)巴什拜羊和盤羊雜交羊差異表達(dá)基因結(jié)果表明:感染MO 4dpi和14dpi巴什拜羊與雜交羊相比較DEGs分別有212個(gè)(上調(diào)146,下調(diào)66)和311個(gè)(上調(diào)158,下調(diào)153)。結(jié)合GO和KEGG分析,我們發(fā)現(xiàn)在感染的肺組織的轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)中存在幾個(gè)與MO感染相關(guān)的有意思的DEGs,包括SPLUC1(BPIFA1)、SP-A(SFTPA-1)、P2X7R、DQA、SOSC1、HO-1(HSP32)、NF-κB、NF-E2、AID、CD19和BAFFR。結(jié)論:本研究篩選出11個(gè)差異表達(dá)基因和相關(guān)信號(hào)通路將為分析巴什拜羊和盤羊雜交感染MO的分子作用機(jī)制奠定了基礎(chǔ)。
【學(xué)位授予單位】：石河子大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2018
【分類號(hào)】：S858.26
【圖文】：

肺臟組織病理學(xué)觀察結(jié)果，A 組巴什拜羊表現(xiàn)為輕度病變，肺組織結(jié)構(gòu)清晰，野肺間質(zhì)增寬，其間有淋巴細(xì)胞、巨噬細(xì)胞及淡粉色滲出液浸潤(rùn)。細(xì)支氣管上皮排則，管腔的周圍有少量炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)（圖 1-2A）。B 組雜交羊均表現(xiàn)重度病變，其圍廣泛，大部分視野可見肺間質(zhì)明顯變寬，壓迫肺間質(zhì)致使連成片，肺泡腔消失，有大量淋巴細(xì)胞浸潤(rùn)，細(xì)支氣管上皮破壞，脫落，管腔內(nèi)有明顯滲出，肺間質(zhì)毛細(xì)支氣管旁小靜脈淤血突出（圖 1-2B）。對(duì)兩個(gè)組綿羊肺部組織病理學(xué)評(píng)分，結(jié)果 A 分為 9.4，B 組平均分 19.9，B 組評(píng)分顯著高于 A 組（P<0.05）。

肺臟組織病理學(xué)觀察結(jié)果，A 組巴什拜羊表現(xiàn)為輕度病變，肺組織結(jié)構(gòu)清晰，野肺間質(zhì)增寬，其間有淋巴細(xì)胞、巨噬細(xì)胞及淡粉色滲出液浸潤(rùn)。細(xì)支氣管上皮排則，管腔的周圍有少量炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)（圖 1-2A）。B 組雜交羊均表現(xiàn)重度病變，其圍廣泛，大部分視野可見肺間質(zhì)明顯變寬，壓迫肺間質(zhì)致使連成片，肺泡腔消失，有大量淋巴細(xì)胞浸潤(rùn)，細(xì)支氣管上皮破壞，脫落，管腔內(nèi)有明顯滲出，肺間質(zhì)毛細(xì)支氣管旁小靜脈淤血突出（圖 1-2B）。對(duì)兩個(gè)組綿羊肺部組織病理學(xué)評(píng)分，結(jié)果 A 分為 9.4，B 組平均分 19.9，B 組評(píng)分顯著高于 A 組（P<0.05）。

圖 1-1B 嚴(yán)重的肉變、肝變、出血點(diǎn)和出血斑Fig1B. serious change of meat , liverdegeneration, hemorrhage points and bleedingspots圖 1-1A 肺部表面有輕微出血點(diǎn)Fig1A. The lungs surface of minor bleedingspots肺臟組織病理學(xué)觀察結(jié)果，A 組巴什拜羊表現(xiàn)為輕度病變，肺組織結(jié)構(gòu)清晰，局野肺間質(zhì)增寬，其間有淋巴細(xì)胞、巨噬細(xì)胞及淡粉色滲出液浸潤(rùn)。細(xì)支氣管上皮排列則，管腔的周圍有少量炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)（圖 1-2A）。B 組雜交羊均表現(xiàn)重度病變，其病圍廣泛，大部分視野可見肺間質(zhì)明顯變寬，壓迫肺間質(zhì)致使連成片，肺泡腔消失，間有大量淋巴細(xì)胞浸潤(rùn)，細(xì)支氣管上皮破壞，脫落，管腔內(nèi)有明顯滲出，肺間質(zhì)毛細(xì)血支氣管旁小靜脈淤血突出（圖 1-2B）。對(duì)兩個(gè)組綿羊肺部組織病理學(xué)評(píng)分，結(jié)果 A 組分為 9.4，B 組平均分 19.9，B 組評(píng)分顯著高于 A 組（P<0.05）。

【參考文獻(xiàn)】

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本文編號(hào)：2800045