【摘要】：豬流行性腹瀉(porcine epidemic diarrhea,PED)是一種經(jīng)糞-口途徑傳播的急性腸道傳染病,其病原為豬流行性腹瀉病毒(porcine epidemic diarrhea virus,PEDV)。PEDV雖然在感染成年豬時(shí)僅產(chǎn)生消瘦等輕微癥狀且鮮見死亡病例,但在感染新生仔豬時(shí)則表現(xiàn)出100%的高發(fā)病率和90%~100%的高致死率。PEDV目前在全球都已有感染并暴發(fā)的報(bào)道,嚴(yán)重威脅著養(yǎng)豬業(yè)的發(fā)展。所以對(duì)PEDV的基礎(chǔ)研究提出了更高的要求,而基于現(xiàn)代測(cè)序技術(shù)的數(shù)據(jù)則具有一定的指導(dǎo)意義。為此,本研究將PEDV接種于無天然免疫缺陷的Marc-145細(xì)胞中,再借助于RNA測(cè)序(RNA-seq)技術(shù)及同位素標(biāo)記相對(duì)和絕對(duì)定量(isobaric Tags for Relative and Absolute Quantification,iTRAQ)技術(shù)分別測(cè)定了感染PEDV前后的Marc-145細(xì)胞的轉(zhuǎn)錄組與蛋白質(zhì)組的變化,并對(duì)兩組數(shù)據(jù)進(jìn)行了生物信息分析及串聯(lián)分析,獲得了以下結(jié)果:1.將對(duì)照組及接毒組細(xì)胞進(jìn)行基于RNA-seq技術(shù)的高通量測(cè)序,在測(cè)序數(shù)據(jù)與非洲綠猴(Chlorocebus sabaeus)參考基因組比對(duì)之后,將鑒定出的基因進(jìn)行功能注釋,最后篩選出接毒組中呈現(xiàn)差異表達(dá)的基因,并對(duì)其進(jìn)行GO(Gene Ontology)與KEGG(Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes)富集分析,結(jié)果如下:從對(duì)照組與接毒組中分別鑒定到18452個(gè)與18286個(gè)基因中共篩選出832個(gè)差異表達(dá)基因,其中表達(dá)上調(diào)的有497個(gè),表達(dá)下調(diào)的有335個(gè);在GO分析的分子功能、細(xì)胞組分及參與的生物過程共3項(xiàng)本體中分別富集到440、291及2700條GO term,其中在生物過程中有27條GO term呈現(xiàn)為顯著富集,主要涉及信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)、應(yīng)激及凋亡等,而在分子功能與細(xì)胞組分中富集程度最高的GO term則分別主要與DNA結(jié)合及細(xì)胞骨架成分有關(guān);在KEGG分析中共富集到167條Pathway,其中有涉及免疫反應(yīng)、凋亡及細(xì)胞周期的Pathway,而呈顯著富集的Pathway則是與胞外信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)密切相關(guān)的MAPK與Jak-STAT信號(hào)通路;與天然免疫、炎性反應(yīng)相關(guān)的基因出現(xiàn)差異表達(dá),其中IFNB1、EGFR、IL11、RSAD2與ISG15等基因的表達(dá)出現(xiàn)了顯著上調(diào),表明在病毒的誘導(dǎo)下,細(xì)胞的天然免疫及炎性反應(yīng)被激活,然而還有IFNA、IL23A等基因的表達(dá)出現(xiàn)了顯著下調(diào),表明PEDV可通過某些機(jī)制抑制了部分的天然免疫及炎性反應(yīng);與細(xì)胞凋亡相關(guān)的基因出現(xiàn)差異表達(dá),其中TRAILR、DFF40、NGF等的上調(diào)表達(dá)與TRAIL、BIRC3的下調(diào)表達(dá)表明在一部分細(xì)胞中凋亡被誘導(dǎo),而在另一部分細(xì)胞中凋亡被抑制,提示病毒可能通過對(duì)細(xì)胞凋亡的調(diào)控以實(shí)現(xiàn)更高的病毒滴度;與細(xì)胞周期相關(guān)的基因出現(xiàn)差異表達(dá),其中GADD45B、p300、Mdm2等的上調(diào)表達(dá)與HSP105、HSP70等的下調(diào)表達(dá)提示可能發(fā)生了細(xì)胞周期阻滯。2.借助了iTRAQ串聯(lián)液相質(zhì)譜對(duì)接毒組及對(duì)照組的Marc-145細(xì)胞進(jìn)行蛋白組學(xué)測(cè)序,將篩選出的差異表達(dá)蛋白進(jìn)行GO與KEGG富集分析,結(jié)果如下:從鑒定到的3346個(gè)蛋白中共篩選出478個(gè)差異表達(dá)蛋白,其中表達(dá)上調(diào)的有423個(gè),表達(dá)下調(diào)的有55個(gè);在GO分析的分子功能、細(xì)胞組分及參與的生物過程共3項(xiàng)本體中分別富集到201、211及1342條GO term,其中顯著富集GO term分別為45、66及255條,分別主要涉及RNA結(jié)合與翻譯調(diào)控、細(xì)胞骨架與通道復(fù)合體、細(xì)胞周期與跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)等;在KEGG分析中共富集到包括p53、mTOR、MAPK信號(hào)通路在內(nèi)的67條pathway,其中顯著富集的有ErbB、HIF-1、Wnt、細(xì)胞周期信號(hào)通路等共29條;核糖體相關(guān)蛋白表達(dá)上調(diào),表明病毒可能正通過劫持細(xì)胞的蛋白合成機(jī)能來進(jìn)行自身的復(fù)制,而其中RPL11、RPL23、RPL26、RPS25、RPS27等蛋白的上調(diào)表達(dá)則提示可能發(fā)生核糖體應(yīng)激;與細(xì)胞骨架相關(guān)的蛋白的表達(dá)發(fā)生變化,其中DCTN2、TUBA4A、MAP4等表達(dá)上調(diào),而HSP27表達(dá)下調(diào),反映了細(xì)胞骨架在病毒的感染下發(fā)生異常,且HSP27的下調(diào)表達(dá)還提示細(xì)胞可能發(fā)生了凋亡;與細(xì)胞周期相關(guān)的Cdc2、Mad1、Bub3蛋白表達(dá)上調(diào),同樣提示了細(xì)胞周期阻滯的發(fā)生。3.在轉(zhuǎn)錄組學(xué)及蛋白組學(xué)測(cè)序的基礎(chǔ)上,對(duì)鑒定到的基因與蛋白進(jìn)行了串聯(lián)分析。在103個(gè)同時(shí)在轉(zhuǎn)錄及翻譯水平發(fā)生變化的蛋白中共發(fā)現(xiàn)有52個(gè)在轉(zhuǎn)錄及翻譯水平上呈現(xiàn)出一致性的變化,其中有35個(gè)出現(xiàn)上調(diào),17個(gè)出現(xiàn)下調(diào),這些蛋白主要與細(xì)胞骨架、細(xì)胞周期、信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)等有關(guān)。而在轉(zhuǎn)錄及翻譯水平上均呈現(xiàn)顯著上調(diào)的TRIM56則可能參與了細(xì)胞對(duì)抗病毒的免疫反應(yīng),但其在PEDV感染過程中的具體作用需要進(jìn)一步研究來報(bào)道,這也是首次在PEDV感染細(xì)胞的過程中發(fā)現(xiàn)該蛋白的參與。
【學(xué)位授予單位】：西北農(nóng)林科技大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2019
【分類號(hào)】：S858.28

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本文編號(hào)：2799430