【摘要】：牛白血病病毒(Bovine leukemia virus,BLV)屬于反轉(zhuǎn)錄病毒科(Retroviridae),丁型反轉(zhuǎn)錄病毒屬(Deltaretrovims)。該病毒會引起牛淋巴細(xì)胞持續(xù)性增生,進而導(dǎo)致牛地方流行性白血病的發(fā)生。BLV的感染和傳播非常普遍,其在中國有較高的流行率。近期,美國學(xué)者的研究發(fā)現(xiàn),人類乳腺上皮細(xì)胞中存在BLVDNA。隨后的研究中發(fā)現(xiàn),BLVDNA在乳腺癌患者的乳腺上皮組織中的陽性率為58.8%(67/114),顯著高于普通人群中的陽性率(28.8%,30/104)。這一發(fā)現(xiàn)提示,BLV感染可能與人類乳腺癌發(fā)生有潛在的聯(lián)系。本研究建立了檢測BLV前病毒的環(huán)介導(dǎo)等溫擴增(Loop-mediated isothermal amplification,LAMP)檢測方法,并基于我國上海、江蘇、安徽等地乳腺癌患者的乳腺組織和全血樣品,采用多種高靈敏度的方法檢測BLV的核酸和抗體,進一步探討B(tài)LV感染與人類乳腺癌發(fā)生的相關(guān)性。一、檢測BLV前病毒的LAMP方法的建立牛地方流行性白血病有多種診斷方法,包括病理組織學(xué)檢測、血液學(xué)檢測、血清學(xué)方法以及分子生物學(xué)檢測。LAMP方法是一種可以在等溫條件下擴增核酸的新型技術(shù),具有操作簡便,檢測成本低的優(yōu)勢。本研究根據(jù)GenBank中提供的BLV基因序列,基于其保守區(qū)域設(shè)計內(nèi)引物、外引物以及環(huán)引物,并建立BLV的LAMP反應(yīng)體系。在此基礎(chǔ)上,通過探索外內(nèi)引物比例、Mg2+濃度、Bst 2.0 DNA酶的添加量以及dNTPs濃度,優(yōu)化LAMP反應(yīng)參數(shù)條件。同時,通過在反應(yīng)體系中加入鈣黃綠素試劑,實現(xiàn)結(jié)果的可視化判定。本研究建立了一種能夠在25 μL反應(yīng)體系中實現(xiàn)單拷貝病毒核酸檢測的BLV LAMP方法,該方法靈敏度優(yōu)于普通PCR檢測方法,并有良好的特異性。二、BLV感染與人乳腺癌發(fā)生相關(guān)性的研究有研究發(fā)現(xiàn)在人的乳腺上皮組織中能夠檢測到BLV DNA,并推測BLV可能與人乳腺癌發(fā)生存在潛在的聯(lián)系。乳腺癌的很多高危因素已被證實,但其發(fā)生的機理尚未清楚。BLV感染是否會引起乳腺癌的發(fā)生,這引起了眾多研究者的關(guān)注。但截止到目前,并未證實BLV感染與乳腺癌發(fā)生存在關(guān)聯(lián)性。根據(jù)我國BLV的分子流行病學(xué)調(diào)查,BLV在上海、江蘇和安徽有較高的陽性率,所以本研究選擇的乳腺癌患者的樣品均來自上述三個地區(qū),主要為乳腺組織樣品和全血樣品。91份乳腺癌患者的冰凍乳腺組織樣品,其中66份來自上海健康所,25份來自江蘇揚州蘇北人民醫(yī)院;160份乳腺癌患者的全血樣品,其中140份由蘇州大學(xué)第三附屬醫(yī)院提供,20份由安徽淮南朝陽醫(yī)院提供。本研究采用100份正常人群全血樣品作為對照組,該樣品來自揚州市蘇北醫(yī)院2013年體檢人群,體檢人群均被確認(rèn)為非乳腺癌患者。此外,本研究在安徽、北京、上海和江蘇四個地區(qū)的奶牛場采集了 150份奶牛全血樣品。本研究為了精確檢測人類體內(nèi)是否存在BLV的核酸和抗體,采用了 LAMP、PCR和ELISA多種高度靈敏、特異的檢測方法。PCR方法包括:1)1種本實驗室建立的FRET-qPCR方法;2)首次報道BLV和乳腺癌相關(guān)性的實驗室建立的檢測方法,包括1種普通PCR方法和5種巢式PCR方法。LAMP方法為本研究所建立的BLV LAMP檢測方法。ELISA方法為針對gp51蛋白的商業(yè)化ELISA試劑盒。奶牛全血樣品檢測的結(jié)果顯示,LAMP和FRET-qPCR兩種方法檢出陽性率為50.0%,檢測結(jié)果高度吻合。其中,ELISA方法檢出陽性率為48.7%,其中4份樣品由于奶牛處于BLV感染早期,體內(nèi)抗體含量未達到ELISA試劑盒檢測限。該結(jié)果證實上述三種檢測方法的可行性。隨后,采用這三種方法分別檢測人的乳腺組織樣品和全血樣品,均未在樣品中檢測出BLV核酸或特異性抗體。此外,本研究使用已報道BLV和乳腺癌相關(guān)性的實驗室建立的檢測方法檢測乳腺組織樣品的核酸,同樣未檢測到BLV的核酸。因此,本研究認(rèn)為BLV感染與上述地區(qū)人類乳腺癌的發(fā)生不存在直接的關(guān)聯(lián)性。綜上所述,本研究建立一種快速、靈敏的BLV LAMP檢測方法,并研究證實在安徽、江蘇、上海等3個地區(qū),BLV的感染與乳腺癌的發(fā)生無相關(guān)性。由于遺傳背景和牛奶消費習(xí)慣等方面的差異,不同人群中BLV的感染與乳腺癌發(fā)生的相關(guān)性還需要進一步的研究。
【學(xué)位授予單位】：揚州大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2018
【分類號】：R737.9;S858.23
【圖文】：

３．邋結(jié)果逡逑３．１模板ＤＮＡ定量逡逑根據(jù)ＰＣＲ擴增的標(biāo)準(zhǔn)曲線（圖２－１），得出標(biāo)準(zhǔn)方程，并計算出樣品Ｂ１３６０的拷貝數(shù)，逡逑近似為２ｘｌ0３拷貝／以，即ＬＡＭＰ反應(yīng)標(biāo)準(zhǔn)品的拷貝數(shù)為２ｘｌ０３拷貝／ｐＬ。逡逑Ｆｌｉａｏｒ？ｓｃS茫椋簦憷馘澹齲椋螅簦錚潁義希椋椋赍義希佩澹澹義希卞澹玻常矗擔(dān)叮罰福瑰危保卞危保沖危鄭峰澹保瑰危玻卞危玻沖危靛危玻峰危玻梗義希茫悖歟澹簀義賢跡玻保澹疲遙剩牛裕瘢校茫曳椒ǘ肯櫧罰攏保常叮爸校攏蹋趾渴笛槔┰鑾咄煎義希疲椋玨澹玻保澹裕瑁邋澹潁澹螅酰歟翦澹錚駑澹疲遙牛裕瘢校茫義澹恚澹簦瑁錚溴澹媯錚蟈澹攏蹋皺澹模危鈴澹洌澹簦澹悖簦椋錚睿義希常插危蹋粒停蟹從σ锏納杓棋義顯讜な笛殄�，针秷A煌幕虺醪繳稈。缸椴煌囊錚溴恚玻持興鏡囊镥義峽詼∫猿曬椖康鈉�。茰O橐锎嬖諞歡ㄈ畢藎械囊錮┰魴式系�，有的引物辶x銜薹ń茇芎玫睦┰觶械囊鐨枰缺湫緣某絳頡Ｔ諭瓿衫┰齜從Φ幕∩�，栽枏摩体辶x舷靛尤牖芬錚估┰齜從σ切瑁矗靛澹恚椋羆純賞瓿傘ｅ義希常沖危蹋粒停蟹從μ逑檔慕㈠義希常常弊釷史從μ逑檔娜范ㄥ義希常常保幣錛潯壤撓嘔義銜范ㄒ錛淶淖鈑瘧壤�，以ＬＡＭＰ窂摩标子嫹为模板，窂摩体系设计染c恚玻粗興義鮮荊從崾笫勾ǎ玻ヅǘ惹碇悄航械纈炯觳�。辶x轄峁礱

本文編號：2799519