【摘要】：MicroRNAs(miRNAs)是存在于生物體內(nèi)22個核苷酸左右的重要短基因片段。其在脂類代謝中也是重要的調(diào)控因子,而脂類是牛奶的主要成分,對幼畜的成長和發(fā)育有著至關(guān)重要的作用。所以,篩選出來這些影響乳脂代謝和乳腺上皮細(xì)胞活力的miRNAs成為研究人員重要的研究工作之一。miR-29b作為眾多關(guān)鍵miRNAs中的一員,參與許多重要的生命過程,包括癌細(xì)胞的增殖遷移和腸上皮細(xì)胞的增殖等。另外,經(jīng)對高脂奶牛和低脂奶牛乳腺組織分析發(fā)現(xiàn),mi R-29b的表達(dá)量在兩者間存在著顯著的差異表達(dá),表明miR-29b可能是調(diào)控脂質(zhì)代謝是關(guān)鍵因子。miR-29b通過調(diào)控靶基因參與乳脂代謝和細(xì)胞凋亡過程,所以本研究首先通過生物信息學(xué)分析預(yù)測并且分析了與miR-29b有關(guān)的潛在靶基因,結(jié)果顯示,mi R-29b可以識別4353個轉(zhuǎn)錄子中5730個結(jié)合位點。經(jīng)功能分析,我們初步鎖定LPL和TDG基因作為本研究的靶基因。LPL-3'-UTR(1802-1809 bp)和TDG-3'-UTR(1057-1064 bp)分別存在能與miR-29b成熟序列所包含的種子序列(AGCACCA)特異性識別的位點。然后根據(jù)結(jié)合位點我們分別設(shè)計了包含LPL-3'-UTR-WT(UGGUGCUA),LPL-3'-UTR-mut(CAAGUACG),TDG-3'-UTR-WT(UGGUGCUA),TDG-3'-UTR-mut(CAAGUACG)的載體。雙熒光素酶報告系統(tǒng)檢測發(fā)現(xiàn),與參照組比較,miR-29b mimics和TDG-3'-UTR-WT共轉(zhuǎn)染組熒光素酶活性顯著低于對照組(p0.05),而和TDG-3'-UTR-mut共轉(zhuǎn)染組與對照組之間無顯著差異(p0.05);miR-29b mimics和LPL-3'-UTR-WT共轉(zhuǎn)染組熒光素酶活性顯著低于對照組(p0.05),其和LPL-3'-UTR-mut共轉(zhuǎn)染組與對照組之間也無顯著差異(p0.05),進(jìn)一步驗證了TDG和LPL是miR-29b的潛在靶基因。為詳細(xì)了解miR-29b是如何在細(xì)胞中發(fā)揮調(diào)控作用的,我們將合成的mi R-29b過表達(dá)載體(miR-29b mimics)、miR-29b抑制劑(miR-29b inhibitor)和陽性對照(miR-shNC)轉(zhuǎn)染到乳腺上皮細(xì)胞中。熒光顯微鏡下觀察到的綠色熒光表明載體成功轉(zhuǎn)染到細(xì)胞中,并且經(jīng)熒光定量檢測說明miR-29b成功在乳腺上皮中過表達(dá)和干擾。實時熒光定量檢測結(jié)果顯示miR-29b mimics組的TDG和LPL mRNA的表達(dá)量顯著降低(p0.01);隨后進(jìn)行的蛋白免疫印跡檢測結(jié)果顯示,TDG和LPL基因表達(dá)蛋白在miR-29b inhibitor組顯著高表達(dá),而在mi R-29b mimics組顯著被下調(diào),綜合以上實驗結(jié)果說明miR-29b可通過降解靶基因的mRNA或抑制靶基因的蛋白翻譯這兩種方式發(fā)揮其作用。隨后,我們在乳腺上皮細(xì)胞中成功的過表達(dá)和干擾mi R-29b,探究mi R-29b對乳脂代謝和細(xì)胞凋亡的影響。經(jīng)流式細(xì)胞儀檢測發(fā)現(xiàn),細(xì)胞凋亡率分別為mi R-29b mimics組(8.78%)、mi R-29b inhibitor組(21.86%)和miR-shNC組(17.1%),表明過表達(dá)miR-29b會抑制乳腺上皮細(xì)胞的凋亡。與此同時,沉默mi R-29b會促進(jìn)乳腺上皮細(xì)胞的凋亡。在接下來的實驗中,我們在乳腺上皮細(xì)胞中分別轉(zhuǎn)染了miR-29b mimics、miR-29b inhibitor和miR-shNC,培養(yǎng)24 h后,檢測了細(xì)胞內(nèi)部甘油三酯的表達(dá)量。結(jié)果顯示過表達(dá)miR-29b會顯著促進(jìn)甘油三酯的生成,但是干擾miR-29b卻對甘油三酯的影響不明顯,說明可能只有在mi R-29b表達(dá)量相對較高時對甘油三酯的形成才有影響。結(jié)合以上實驗結(jié)果,我們推測miR-29b可能通過下調(diào)靶基因TDG和LPL實現(xiàn)其抑制乳腺上皮細(xì)胞凋亡和促進(jìn)甘油三酯含量增多,為乳脂代謝過程提供基本的理論依據(jù)和分子機制分析。
【學(xué)位授予單位】：吉林大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2018
【分類號】：S852.2
【圖文】：

圖 2.1 miRNA 與靶 mRNA 的作用模式圖Fig. 2.1 Relationship between miRNA and target mRNA-29b 與靶 mRNA 的作用模式有以下幾種：首先，如果二者不完全互miRNA 與靶基因之間有特異性識別序列，但不能保證種子區(qū)完全，會影響靶基因翻譯過程的正常進(jìn)行而對 mRNA 的穩(wěn)定性無任蟲的 lin-4。第二種方式也就是二者完全互補，miRNA 種子區(qū)和分堿基完全配對結(jié)合后，類似 siRNA 與靶 mRNA 的結(jié)合，會發(fā)割 mRNA，如 miR39/miR171。最后，如果上述兩種模式均具備。解靶基因與抑制蛋白翻譯兩種模式，如 let-7 果蠅/線蟲。L-2 家族的 BAG3 可以與 MMP2 基因相結(jié)合，而 miR-29b 可以通過結(jié)合，從而在子宮內(nèi)膜樣腺癌細(xì)胞的侵襲過程中發(fā)揮作用[82]。轉(zhuǎn)TGF β1）是調(diào)節(jié)纖維化和器官功能正常發(fā)揮的一把起到關(guān)鍵作icroRNA-29b 可以作為治療子宮內(nèi)膜纖維化潛在的治療劑，通

igh density lipoprotein, HDL）。酯和極低密度脂蛋白（VLDL）水解的過程中，LP指的是催化循環(huán)乳糜微粒水解，使其分解為游離脂能將極低密度脂蛋白膽固醇轉(zhuǎn)變?yōu)榈兔芏戎鞍啄懨游⒘：椭虚g密度脂蛋白的釋放能夠間接影響高密[109]，LPL 的缺失或是活性降低均會導(dǎo)致 VLDL 的降 發(fā)揮功能的過程中，它也會受到多種 miRNAs 的能靶向巨噬細(xì)胞內(nèi)的 LPL，沉默 LPL 基因后影響脂質(zhì)動脈粥樣硬化的發(fā)生發(fā)展[110]。在牦牛的脂肪細(xì)胞中的 3'UTR 的靶序列，增加了脂肪細(xì)胞特異性基因在脂。在小鼠的脂肪細(xì)胞中，miR-185 通過負(fù)調(diào)控 LPL 抑

中必不可少的重要部分。在激活 CBP 的轉(zhuǎn)錄調(diào)控中，TDG 會與組蛋酶(Histone deacetylase, HDAC)和 CREB 結(jié)合蛋白共同作用進(jìn)行維持。此G 也會與視黃酸受體 α（Retinoic acid receptorα, RARα）相互作用，激活體 α 基因下游的靶基因。同時，在 5-甲基胞嘧啶（5-MeC）和胞嘧啶中引發(fā)的 DNA 錯配，從而在后期的 G/T 和 G/Ud 胞嘧啶堿基切除ER）過程中都起到了決定性的作用[144]。 TDG 功能分析

【參考文獻(xiàn)】

相關(guān)期刊論文 前3條

1 韋璇;徐小春;楊雨鑫;王小龍;陳玉林;牛文智;寇啟芳;;CCAAT/增強子結(jié)合蛋白α(C/EBPα)與脂蛋白酯酶(LPL)基因在不同尾型綿羊品種尾部脂肪組織中的表達(dá)[J];農(nóng)業(yè)生物技術(shù)學(xué)報;2014年05期

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相關(guān)博士學(xué)位論文 前1條

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相關(guān)碩士學(xué)位論文 前2條

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本文編號：2797929