【摘要】：(1)試驗利用組織學(xué)和轉(zhuǎn)錄組學(xué)技術(shù),對在暖季(W-yak)和冷季(C-yak)的牦牛卵巢狀態(tài)變化進行研究。收集的卵巢樣品分為W-yak和C-yak兩組,分別測定其黃體數(shù)量、卵泡發(fā)育和RNA-Seq分析。結(jié)果表明:(1)W-yak牦牛黃體數(shù)量明顯高于C-yak(P0.05),其中8月和9月的牦牛排卵最為集中;(2)C-yak(11月)卵巢中卵泡發(fā)育過程中斷,與W-yak(7月)相比,這是由于竇卵泡的異常積聚所導(dǎo)致;(3)多囊泡現(xiàn)象代表C-yak卵巢竇卵泡內(nèi)顆粒細胞功能紊亂;(4)RNA-seq數(shù)據(jù)顯示,如FST,CYP1A1,GNAI2和PI3K等雌激素分泌和代謝信號通路在C-yak卵巢中是紊亂的,本研究獲得W-yak和C-yak之間卵巢形態(tài)變化和不同基因表達,并提供了與卵巢狀態(tài)相關(guān)的試驗數(shù)據(jù)。卵巢功能的這些重要變化與繁殖能力緊密相關(guān)。結(jié)果表明季節(jié)和氣候變化不利于雌性生殖健康,并為長期營養(yǎng)缺乏和低溫脅迫下可能導(dǎo)致卵巢功能障礙提供理論依據(jù)。(2)研究在卵母細胞成熟和/或胚胎培養(yǎng)液中添加不同濃度的褪黑素對牦牛卵母細胞體外成熟和胚胎體外發(fā)育的影響;結(jié)果表明,在試驗1中,與對照組相比,IVC+10~(-9)組和IVC+10~(-11)組,卵母細胞成熟率顯著提高(67.9%vs 82.4%,78.4%),囊胚率形成顯著提高(36.8%,34.4%vs 26.3%),成熟卵母細胞降低ROS水平、細胞凋亡率和紡錘體錯位與染色體異常的發(fā)生率,提高線粒體膜電位;在試驗2中,在胚胎體外培養(yǎng)中,與對照組相比,IVC+10~(-9)組和IVC+10~(-11)組囊胚率顯著提高(26.3%vs 35.4%,31.8%)。此外,與對照組相比,在IVC+10~(-9)組中觀察到囊胚中凋亡細胞的數(shù)量和百分比降低(6.9±0.6;5.5%vs 3.5±0.4;3.0%)。在試驗3中,IVC+10~(-9)組減少囊胚凋亡細胞數(shù),抗氧化基因(SOD2)和熱休克蛋白(HSPB1)mRNA表達量升高,促凋亡基因p53、Bax和capase-3的表達量降低,抗凋亡基因BCL2L1、Survivin的表達水平顯著高于對照組;與IVM+10~(-9)相比,IVM/IVC+10~(-9)處理組的活性氧物質(zhì)產(chǎn)量升高。總之,添加10~(-9)M濃度的褪黑素在牦牛胚胎體外生產(chǎn)階段直接影響胚胎發(fā)育能力和質(zhì)量。(3)褪黑素作為一種抗氧化劑在多種細胞中扮演著重要的角色,保護細胞內(nèi)的分子免受氧化應(yīng)激,褪黑素在牦牛胚胎中的抗氧化作用機制尚不清楚。在H_2O_2氧化應(yīng)激下,通過對牦牛胚胎培養(yǎng)過程中添加不同濃度的褪黑素,考察牦牛胚胎發(fā)育過程中卵裂及囊胚形成的影響,并通過檢測受精卵內(nèi)活性氧水平、線粒體膜電位、抗氧化酶活性、細胞數(shù)量及內(nèi)細胞團(ICM)/細胞總數(shù)(TCN)的比值等指標,考察褪黑素在牦牛胚胎中的抗氧化作用機制,結(jié)果表明,牦牛受精卵暴露于褪黑素的環(huán)境下,保護牦牛胚胎發(fā)育免受過氧化氫(H_2O_2)誘導(dǎo)的氧化應(yīng)激損傷,保持受精卵線粒體功能穩(wěn)定,T-AOC、GSH-Px、CAT活性升高,降低了H_2O_2誘導(dǎo)的細胞內(nèi)ROS水平,進一步證明褪黑素通過保存抗氧化酶來保護著床前胚胎免受氧化損傷。這些結(jié)果共同證實了褪黑素對牦牛胚胎發(fā)育過程中的抗氧化作用,顯著提高了牦牛胚胎體外生產(chǎn)中囊胚的數(shù)量和質(zhì)量。(4)褪黑素減少了牦牛SCNT胚胎的細胞凋亡和ROS水平,增加了細胞數(shù)量,ICM細胞數(shù)量,以及ICM與TCN的比例;基因表達分析表明,褪黑素抑制促凋亡基因p53和Bax的表達,并刺激SCNT囊胚中抗氧化基因SOD2和Gpx4,抗凋亡基因BCL2L1和多能性相關(guān)基因SOX2的表達。在囊胚期添加褪黑素,SCNT-T組胚胎的全基因組H3K9ac水平高于SCNT組胚胎。結(jié)論,外源性褪黑素可以影響與細胞凋亡,抗氧化功能和發(fā)育相關(guān)的基因的表達,減少牦牛SCNT胚胎的細胞凋亡和ROS水平,提高胚泡質(zhì)量,從而最終提高牦牛的克隆效率。(5)探討褪黑素處理成纖維細胞后,將其作為供體細胞對牦牛體細胞核移植隆牦牛胚胎體外發(fā)育能力和質(zhì)量的影響。在10~(-9) M褪黑素濃度下,顯著增強成纖維細胞(PFF)的增殖,供體細胞甲基化水平H3K9me3、H3K9me2、和H3K18ac顯著升高,促凋亡基因p53、Bax的表達水平明顯降低,抗凋亡基因BCL2L1的表達水平明顯增加,并且在10~(-9) M褪黑素處理的供體細胞組中囊胚率顯著增加,細胞總數(shù)和ICM細胞數(shù)以及囊胚的ICM:TCN的比率顯著提高;降低囊胚期胚胎凋亡細胞的發(fā)生率和細胞內(nèi)ROS水平,提高的全基因組H3K9ac和H3K18ac乙�；�;囊胚中發(fā)育相關(guān)基因OCT4和多能性相關(guān)基因SOX2,抗氧化基因SOD2、Gpx4和熱應(yīng)激蛋白HSPB1的表達水平在SCNT-T組中顯著上調(diào),促凋亡基因p53和Bax的表達水平顯著低于SCNT組,抗凋亡基因BCL2L1和Survivin表達水平顯著高于對照組和SCNT組。本研究確定了供體細胞的經(jīng)褪黑素處理可以促進牦牛克隆胚胎的發(fā)育。10~-99 M褪黑素的最佳濃度處理的重構(gòu)胚,可以增強牦牛SCNT囊胚的形成和改善胚胎質(zhì)量。
【學(xué)位授予單位】：西北農(nóng)林科技大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2019
【分類號】：S823.85
【圖文】：

圖 1-2. 褪黑素在不同階段的應(yīng)用對合和體外胚胎產(chǎn)生的影響Figure1-2. Effects of melatonin application in different steps on gametes and in vitro embryoproduction.褪黑素作為一種有效的自由基清除劑，可直接降低 ROS 濃度，防止內(nèi)源性抗氧化酶的消耗；清除潛在抗氧化劑對 ROS 的反應(yīng)，包括單態(tài)氧、一氧化氮、過氧化氫、氫氧自由基，以及 RNS 包括硝酸、過氧亞硝基、過氧亞硝基酸等。褪黑素能夠上調(diào)幾種抗氧化蛋白的基因表達和活性，線粒體最佳功能得以保留，有助于維持抗氧化應(yīng)激的穩(wěn)態(tài)，其代謝產(chǎn)物表現(xiàn)出強大的抗氧化能力（Mayo, Sainz et al. 2002, Carmen, Juan C etal. 2010）。褪黑素很容易與釋放 NO 的超氧化物結(jié)合，從而阻止過氧亞硝酸鹽的形成，這是一種比 NO 更有害的自由基。它被描述為一種直接過氧化亞硝酸鹽清除劑（Thakor,Herrera et al. 2010）。1.2.5 褪黑素調(diào)節(jié)合子和體外生產(chǎn)的氧化應(yīng)激褪黑素的兩親性使褪黑素能夠容易通過生物屏障。這種特性使其成為一種有效的抗氧化劑，從而保護胚胎免受 ROS 的侵害（Cruz, Leal et al. 2014）。在對哺乳動物卵母

冷暖季節(jié)放牧牦牛Figure2-1Yakgrazinginwarmandcoldseasons

圖 2-2. 冷暖季節(jié)牦牛卵巢黃體、生長卵泡、有腔卵泡和成熟卵泡數(shù)量及形態(tài)學(xué)觀察Figure 2-2. Morphological observationmean and number of corpus luteum, growing, antral and maturefollicles per yak ovary in warm and cold season注：比較不同季節(jié)牦牛卵巢黃體、生長卵泡、有腔卵泡和成熟卵泡的平均數(shù)量。A：2016 年 7 月至 12 月每個卵巢黃體平均數(shù)量。B：2016 年 7 月至 12 月每個卵巢生長卵泡數(shù)量。C：2016 年 7 月至 2016 年 12 月每個卵巢的竇卵泡數(shù)量。D：2016 年 7 月至 12 月每個卵巢成熟卵泡數(shù)。E：牦牛卵巢不同發(fā)育階段卵泡的分類。組間差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）。數(shù)據(jù)表示為平均值±標準差，試驗重復(fù)三次。標尺=100μm。Note: A: The mean number of corpus luteum per ovary from July to December in 2016. B: The number of growing folliclesper ovary from from July to December in 2016. C：The number of antral follicles per ovary from from July to December in2016. D：The number of mature follicles per ovary from from July to December in 2016. E：Classification of different

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