【摘要】：近年來由空腸彎曲桿菌感染引起的人類及動物性疾病越來越多,為了更好的預(yù)防和控制疾病的產(chǎn)生,必需更加清楚的了解致病菌毒性產(chǎn)生的機制和原因。另外由CRISPR(Clustered regularly interspaced short palindromic repeat)和Cas基因(CRISPR-associated)組成的CRISPR-Cas系統(tǒng)作為細菌的一種適應(yīng)性免疫系統(tǒng),被發(fā)現(xiàn)其與細菌的毒力有密切的相關(guān)性。CRISPR-Cas系統(tǒng)通過整合外源的DNA進入CRISPR序列中,來識別二次入侵的外源DNA從而將外源DNA降解,達到抵抗外源可遺傳物質(zhì)入侵的目的。既然CRISPR-Cas系統(tǒng)可以阻止外源DNA對自身的損害,那么CRISPR-Cas系統(tǒng)是否也可以使細菌能夠更快或更慢的進入到其他的生物體中。近十年來,CRISPR-Cas9系統(tǒng)作為一種新型的基因編輯技術(shù)已經(jīng)在不同的生物體中被應(yīng)用。雖然CRISPR-Cas9系統(tǒng)作為一種新型的基因編輯技術(shù)在不同的生物體中都被應(yīng)用,但是它對細菌的作用,卻還停留在適應(yīng)性免疫防御的作用,對細菌毒力方面的作用,目前還很少有相關(guān)的文獻報道。所以本課題研究的目的是了解肉雞空腸彎曲桿菌NCTC11168中Cas9基因和毒力之間的關(guān)系。主要從兩個方面來探討Cas9和毒力的關(guān)系,一方面從毒力表型考察,另一方面從毒力基因型探討。通過結(jié)合這兩個方面,全面了解Cas9和細菌毒力的關(guān)系,從而為解決空腸彎曲桿菌的風(fēng)險管理和危害控制提供更多的理論依據(jù)。采取融合PCR技術(shù)構(gòu)建同源重組載體。在Cas9基因的上游和下游各擴增1300bp左右的片段,并擴增出Kan基因,大小約1200bp作為篩選基因,然后將這三個片段按照融合PCR的方法以上游片段-Kan基因-下游片段的順序連接起來,最后再連接到pGEM-Teasy載體上,構(gòu)建出同源重組載體p3HKan5H。將p3HKan5H載體通過電轉(zhuǎn)化和自然轉(zhuǎn)化進入空腸彎曲桿菌NCTC11168中,篩選出突變菌,并進行突變體的驗證。測定野生菌與突變菌的生長能力、鞭毛的形態(tài)和遷移力、生物膜的情況,來考察Cas9基因?qū)毦陨矶玖Ρ硇偷挠绊�。測定的生長力的結(jié)果顯示:采用t檢測的方法考察,野生型菌與突變菌的生長力并沒有顯著性差異。遷移力的結(jié)果顯示:野生型菌的遷移力明顯比突變菌強,兩者之間存在著顯著的差異性。遷移力主要與細菌的鞭毛運動有關(guān),既然遷移力有顯著的差異性,可能Cas9基因?qū)毦谋廾幸欢ǖ淖饔�。所以采用冷凍透射電鏡觀察鞭毛的形態(tài),觀察其是否有顯著的變化,但是結(jié)果顯示,野生型菌與突變菌的兩極都存有較長的且完整的鞭毛,說明敲除Cas9基因后,鞭毛的形態(tài)并沒有發(fā)生顯著變化。生物膜結(jié)果顯示:突變菌的生物膜的形成能力比野生菌的弱�？梢猿醪秸f明Cas9基因?qū)漳c彎曲桿菌的毒力是有一定的影響的。測定了細菌本身的毒力變化外,還需要對細菌的體外毒性進行檢測,包括檢測菌株對細胞的侵襲力和粘附力,以及菌株在體外的生存能力。實驗采用鼠源的巨噬細胞RAW264.7和結(jié)腸癌細胞Caco-2,采用慶大霉素保護法對野生型菌和突變菌進行細胞實驗。實驗結(jié)果顯示,敲除Cas9基因后,對粘附力和侵襲力并沒有顯著性差異,但對細胞內(nèi)的生存能力具有顯著性差異,表現(xiàn)出減弱的趨勢。采用MTT實驗方法來測定細菌的毒力產(chǎn)生能力,通過測定細菌的產(chǎn)毒能力,來檢測細菌的致病性。實驗結(jié)果顯示,兩者之間有顯著的差異性且野生菌比突變菌的產(chǎn)毒能力強,說明敲除Cas9基因后,細菌的產(chǎn)毒能力下降。本實驗采用第二代測序技術(shù)(Next-Generation Sequencing,NGS),基于Illumina NextSeq500測序平臺,對構(gòu)建的文庫進行雙末端(Paired-end,PE)測序。RNA-Seq的主要目的是檢測敲除Cas9基因后,有哪些毒力基因會發(fā)生變化,從而找出Cas9基因與這些毒力基因的關(guān)系�？偟脕碚f,表型結(jié)果顯示,△Cas9突變體與野生型菌相比,在遷移力、生物膜的形成能力、細胞內(nèi)的生存能力以及產(chǎn)毒能力這四個方面均表現(xiàn)出減弱。毒力基因型方面,RNA-Seq結(jié)果顯示,所有的差異基因中,只有被敲除的Cas9基因出現(xiàn)下調(diào),其他的基因均表現(xiàn)出上調(diào),上調(diào)表達的基因中并沒有出現(xiàn)直接與毒力相關(guān)的基因,都是一些參與代謝的蛋白以及功能未知的假定蛋白。綜合分析得出,敲除Cas9基因,毒力表型表現(xiàn)出下調(diào)的作用,毒力基因型并沒有出現(xiàn)直接的變化,考慮可能是通過負調(diào)控的作用來調(diào)控相關(guān)毒力的變化。
【學(xué)位授予單位】：華中農(nóng)業(yè)大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2018
【分類號】：S852.61
【圖文】：

2.6.1 載體構(gòu)建方案采用融合 PCR 方法構(gòu)建缺失突變體載體，融合 PCR 構(gòu)建缺失突變體載體的方案如圖2-1。由于之前所用的菌株是之前實驗室篩選出來的多耐藥強致病菌株1655，但是根據(jù)已有的全基因組測序結(jié)果設(shè)計引物擴增同源臂、Cas9 基因及 Cas9+片段，都擴增不出正確的條帶，即使是擴增出來大小與目的大小一致的條帶，送公司測序一樣是比對不上，所以最后確定換菌株，換成野生型菌 NCTC11168 來進行實驗。在NCBI 上通過 Blast 從空腸彎曲桿菌 NCTC11168 的基因組中找到 Cas9 基因，并將該基因上游和下游緊鄰的序列片段一并找出。設(shè)計引物對 3H-F1/R1擴增 1300 bp 左右的上游同源臂片段，引物對 5H-F1/R1擴增 1300 bp 左右的下游同源臂片段，以空腸彎曲菌 NCTC11168 為模板進行 3H 和 5H 的擴增。同時設(shè)計引物對 Kan-F2/R2擴增Kan 基因盒。使引物 Kan-F2的 5

圖 3-1 擴增 Kan 基因的結(jié)果Fig.3-1 PCR result of Kan gene注：M：2000Marker 1-5 泳道：Kan 基因Note: M: 2000Marker 1-5 lane: Kan gene5kb

圖 3-2 擴增 3H 同源臂的結(jié)果Fig.3-2 PCR result of 3H homologous arm注：M：2000Marker 1-3 泳道：3H 片段Note: M: 2000Marker 1-3 lane: 3H fragment0.75kb

【相似文獻】

相關(guān)期刊論文 前10條

1 王斌,葉冬青;耶爾森菌強毒力島[J];微生物學(xué)通報;2003年03期

2 胡靜;耶爾森菌強毒力島的水平轉(zhuǎn)移機制[J];國外醫(yī)學(xué)(流行病學(xué)傳染病學(xué)分冊);2002年03期

3 徐建國;毒力島和細菌毒力的進化[J];中華微生物學(xué)和免疫學(xué)雜志;1999年02期

4 郭耀武,瞿勝,汪斌和;毒力島殺滅德國小蠊效果觀察[J];中華衛(wèi)生殺蟲藥械;2001年04期

5 林國平;“毒力島”對德國小蠊現(xiàn)場殺滅效果觀察[J];衛(wèi)生殺蟲藥械;2001年02期

6 潘玲;細菌的毒力島研究簡況[J];畜牧獸醫(yī)科技信息;1999年21期

7 岳永杰,孫養(yǎng)信,阮春來;1%毒力島殺蟑餌劑對蟑螂的滅效研究[J];中華衛(wèi)生殺蟲藥械;2005年02期

8 張集,葉長蕓,徐建國;生物信息學(xué)在毒力島研究中的應(yīng)用[J];疾病監(jiān)測;2005年04期

9 程伯鯤;;腸致病性大腸埃希菌的LEE毒力島[J];國外醫(yī)學(xué)(微生物學(xué)分冊);2000年03期

10 李連青,朱慶義,徐建國,程伯鯤,周向紅,趙瑞珍,李一平;攜帶毒力島大腸桿菌性小兒腹瀉[J];中華醫(yī)學(xué)雜志;2001年23期

相關(guān)會議論文 前10條

1 王玉炯;曾瑾;鄧光存;;毒力島與細菌致病性[A];2006中國微生物學(xué)會第九次全國會員代表大會暨學(xué)術(shù)年會論文摘要集[C];2006年

2 曹虹;陳麗丹;楊軍;貢樹基;黃勝和;;腦膜炎大腸桿菌毒力島新基因cgIE的表達、功能分析和鑒定[A];第十次中國生物物理學(xué)術(shù)大會論文摘要集[C];2006年

3 史秋梅;張艷英;高桂生;房海;陳翠珍;盧會鵬;王曉珊;李艷云;吳楠;郭楊柳;;水貂致瀉性大腸桿菌中耶爾森菌強毒力島的分子流行病學(xué)[A];中國毛皮動物科學(xué)研究進展——2014年全國毛皮動物專業(yè)學(xué)術(shù)研討會論文集[C];2014年

4 曹虹;陳麗丹;楊軍;貢樹基;黃勝和;;腦膜炎大腸桿菌毒力島新基因cglE的表達、功能分析和鑒定[A];2006中國微生物學(xué)會第九次全國會員代表大會暨學(xué)術(shù)年會論文摘要集[C];2006年

5 徐彬;范紅結(jié);;對馬鏈球菌獸疫亞種強毒株自然突變產(chǎn)生的毒力衰減株的特征性分析——馬鏈球菌獸疫亞種毒力形成機理研究[A];第五屆全國人畜共患病學(xué)術(shù)研討會論文摘要集[C];2017年

6 楊少華;柴同杰;;斷奶腹瀉幼兔腸致病性大腸桿菌LEE毒力島的分子流行病學(xué)調(diào)查初報[A];中國畜牧獸醫(yī)學(xué)會動物微生態(tài)學(xué)分會第三屆第七次學(xué)術(shù)研討會論文集[C];2004年

7 呂雪蓮;周薇;劉松艷;曹俊;張童利;王曼宇;劉思國;于申業(yè);;腸炎沙門氏菌三種主要毒力島基因缺失株的構(gòu)建及其免疫效力研究[A];第十屆全國免疫學(xué)學(xué)術(shù)大會匯編[C];2015年

8 張悅;李蓓蓓;馬志永;;大腸桿菌毒力島的研究現(xiàn)狀[A];中國畜牧獸醫(yī)學(xué)會家畜傳染病學(xué)分會第八屆全國會員代表大會暨第十五次學(xué)術(shù)研討會論文集[C];2013年

9 程瓊;龐瑞亮;王若晨;蘇方超;劉軍軍;魏建忠;孫裴;王桂軍;李郁;;不同來源沙門氏菌對小鼠致病力的比較研究及毒力基因的檢測分析[A];中國畜牧獸醫(yī)學(xué)會動物傳染病學(xué)分會第十二次人獸共患病學(xué)術(shù)研討會暨第六屆第十四次教學(xué)專業(yè)委員會論文集[C];2012年

10 方艷紅;孫裴;魏建忠;王桂軍;李郁;;沙門菌毒力基因研究進展[A];中國畜牧獸醫(yī)學(xué)會食品衛(wèi)生學(xué)分會第十一次學(xué)術(shù)研討會論文集[C];2010年

相關(guān)重要報紙文章 前1條

1 通訊員 施水泉;嬰幼兒為何常常腹瀉[N];浙江日報;2001年

相關(guān)博士學(xué)位論文 前5條

1 齊

本文編號：2797918