【摘要】：近年來由空腸彎曲桿菌感染引起的人類及動(dòng)物性疾病越來越多,為了更好的預(yù)防和控制疾病的產(chǎn)生,必需更加清楚的了解致病菌毒性產(chǎn)生的機(jī)制和原因。另外由CRISPR(Clustered regularly interspaced short palindromic repeat)和Cas基因(CRISPR-associated)組成的CRISPR-Cas系統(tǒng)作為細(xì)菌的一種適應(yīng)性免疫系統(tǒng),被發(fā)現(xiàn)其與細(xì)菌的毒力有密切的相關(guān)性。CRISPR-Cas系統(tǒng)通過整合外源的DNA進(jìn)入CRISPR序列中,來識(shí)別二次入侵的外源DNA從而將外源DNA降解,達(dá)到抵抗外源可遺傳物質(zhì)入侵的目的。既然CRISPR-Cas系統(tǒng)可以阻止外源DNA對(duì)自身的損害,那么CRISPR-Cas系統(tǒng)是否也可以使細(xì)菌能夠更快或更慢的進(jìn)入到其他的生物體中。近十年來,CRISPR-Cas9系統(tǒng)作為一種新型的基因編輯技術(shù)已經(jīng)在不同的生物體中被應(yīng)用。雖然CRISPR-Cas9系統(tǒng)作為一種新型的基因編輯技術(shù)在不同的生物體中都被應(yīng)用,但是它對(duì)細(xì)菌的作用,卻還停留在適應(yīng)性免疫防御的作用,對(duì)細(xì)菌毒力方面的作用,目前還很少有相關(guān)的文獻(xiàn)報(bào)道。所以本課題研究的目的是了解肉雞空腸彎曲桿菌NCTC11168中Cas9基因和毒力之間的關(guān)系。主要從兩個(gè)方面來探討Cas9和毒力的關(guān)系,一方面從毒力表型考察,另一方面從毒力基因型探討。通過結(jié)合這兩個(gè)方面,全面了解Cas9和細(xì)菌毒力的關(guān)系,從而為解決空腸彎曲桿菌的風(fēng)險(xiǎn)管理和危害控制提供更多的理論依據(jù)。采取融合PCR技術(shù)構(gòu)建同源重組載體。在Cas9基因的上游和下游各擴(kuò)增1300bp左右的片段,并擴(kuò)增出Kan基因,大小約1200bp作為篩選基因,然后將這三個(gè)片段按照融合PCR的方法以上游片段-Kan基因-下游片段的順序連接起來,最后再連接到pGEM-Teasy載體上,構(gòu)建出同源重組載體p3HKan5H。將p3HKan5H載體通過電轉(zhuǎn)化和自然轉(zhuǎn)化進(jìn)入空腸彎曲桿菌NCTC11168中,篩選出突變菌,并進(jìn)行突變體的驗(yàn)證。測定野生菌與突變菌的生長能力、鞭毛的形態(tài)和遷移力、生物膜的情況,來考察Cas9基因?qū)?xì)菌自身毒力表型的影響。測定的生長力的結(jié)果顯示:采用t檢測的方法考察,野生型菌與突變菌的生長力并沒有顯著性差異。遷移力的結(jié)果顯示:野生型菌的遷移力明顯比突變菌強(qiáng),兩者之間存在著顯著的差異性。遷移力主要與細(xì)菌的鞭毛運(yùn)動(dòng)有關(guān),既然遷移力有顯著的差異性,可能Cas9基因?qū)?xì)菌的鞭毛有一定的作用。所以采用冷凍透射電鏡觀察鞭毛的形態(tài),觀察其是否有顯著的變化,但是結(jié)果顯示,野生型菌與突變菌的兩極都存有較長的且完整的鞭毛,說明敲除Cas9基因后,鞭毛的形態(tài)并沒有發(fā)生顯著變化。生物膜結(jié)果顯示:突變菌的生物膜的形成能力比野生菌的弱。可以初步說明Cas9基因?qū)漳c彎曲桿菌的毒力是有一定的影響的。測定了細(xì)菌本身的毒力變化外,還需要對(duì)細(xì)菌的體外毒性進(jìn)行檢測,包括檢測菌株對(duì)細(xì)胞的侵襲力和粘附力,以及菌株在體外的生存能力。實(shí)驗(yàn)采用鼠源的巨噬細(xì)胞RAW264.7和結(jié)腸癌細(xì)胞Caco-2,采用慶大霉素保護(hù)法對(duì)野生型菌和突變菌進(jìn)行細(xì)胞實(shí)驗(yàn)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,敲除Cas9基因后,對(duì)粘附力和侵襲力并沒有顯著性差異,但對(duì)細(xì)胞內(nèi)的生存能力具有顯著性差異,表現(xiàn)出減弱的趨勢。采用MTT實(shí)驗(yàn)方法來測定細(xì)菌的毒力產(chǎn)生能力,通過測定細(xì)菌的產(chǎn)毒能力,來檢測細(xì)菌的致病性。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,兩者之間有顯著的差異性且野生菌比突變菌的產(chǎn)毒能力強(qiáng),說明敲除Cas9基因后,細(xì)菌的產(chǎn)毒能力下降。本實(shí)驗(yàn)采用第二代測序技術(shù)(Next-Generation Sequencing,NGS),基于Illumina NextSeq500測序平臺(tái),對(duì)構(gòu)建的文庫進(jìn)行雙末端(Paired-end,PE)測序。RNA-Seq的主要目的是檢測敲除Cas9基因后,有哪些毒力基因會(huì)發(fā)生變化,從而找出Cas9基因與這些毒力基因的關(guān)系�？偟脕碚f,表型結(jié)果顯示,△Cas9突變體與野生型菌相比,在遷移力、生物膜的形成能力、細(xì)胞內(nèi)的生存能力以及產(chǎn)毒能力這四個(gè)方面均表現(xiàn)出減弱。毒力基因型方面,RNA-Seq結(jié)果顯示,所有的差異基因中,只有被敲除的Cas9基因出現(xiàn)下調(diào),其他的基因均表現(xiàn)出上調(diào),上調(diào)表達(dá)的基因中并沒有出現(xiàn)直接與毒力相關(guān)的基因,都是一些參與代謝的蛋白以及功能未知的假定蛋白。綜合分析得出,敲除Cas9基因,毒力表型表現(xiàn)出下調(diào)的作用,毒力基因型并沒有出現(xiàn)直接的變化,考慮可能是通過負(fù)調(diào)控的作用來調(diào)控相關(guān)毒力的變化。
【學(xué)位授予單位】：華中農(nóng)業(yè)大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2018
【分類號(hào)】：S852.61
【圖文】：

2.6.1 載體構(gòu)建方案采用融合 PCR 方法構(gòu)建缺失突變體載體，融合 PCR 構(gòu)建缺失突變體載體的方案如圖2-1。由于之前所用的菌株是之前實(shí)驗(yàn)室篩選出來的多耐藥強(qiáng)致病菌株1655，但是根據(jù)已有的全基因組測序結(jié)果設(shè)計(jì)引物擴(kuò)增同源臂、Cas9 基因及 Cas9+片段，都擴(kuò)增不出正確的條帶，即使是擴(kuò)增出來大小與目的大小一致的條帶，送公司測序一樣是比對(duì)不上，所以最后確定換菌株，換成野生型菌 NCTC11168 來進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。在NCBI 上通過 Blast 從空腸彎曲桿菌 NCTC11168 的基因組中找到 Cas9 基因，并將該基因上游和下游緊鄰的序列片段一并找出。設(shè)計(jì)引物對(duì) 3H-F1/R1擴(kuò)增 1300 bp 左右的上游同源臂片段，引物對(duì) 5H-F1/R1擴(kuò)增 1300 bp 左右的下游同源臂片段，以空腸彎曲菌 NCTC11168 為模板進(jìn)行 3H 和 5H 的擴(kuò)增。同時(shí)設(shè)計(jì)引物對(duì) Kan-F2/R2擴(kuò)增Kan 基因盒。使引物 Kan-F2的 5

圖 3-1 擴(kuò)增 Kan 基因的結(jié)果Fig.3-1 PCR result of Kan gene注：M：2000Marker 1-5 泳道：Kan 基因Note: M: 2000Marker 1-5 lane: Kan gene5kb

圖 3-2 擴(kuò)增 3H 同源臂的結(jié)果Fig.3-2 PCR result of 3H homologous arm注：M：2000Marker 1-3 泳道：3H 片段Note: M: 2000Marker 1-3 lane: 3H fragment0.75kb

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