【摘要】：家兔皮膚真菌病是養(yǎng)兔生產(chǎn)中的一種常見疾病,該病主要由絲狀真菌侵入家兔皮膚角質(zhì)層及其附屬物(如兔毛,指甲)所引起。須毛癬菌是該病的主要致病菌,它可通過分泌枯草桿菌蛋白酶和金屬蛋白酶來入侵宿主富含角蛋白的結(jié)構(gòu)。目前家兔應(yīng)答皮膚真菌感染的機制尚不清楚,因此本研究擬用RNA-seq技術(shù)從轉(zhuǎn)錄組水平鑒定與家兔皮膚真菌病形成相關(guān)的蛋白編碼基因和lncRNAs,并在細胞層面探討部分候選蛋白編碼基因在家兔皮膚真菌病發(fā)病過程中的功能。本研究首先用須毛癬菌感染天府黑兔母兔背部皮膚,構(gòu)建家兔皮膚真菌病模型;接著,利用RNA-seq技術(shù)和生物信息學(xué)技術(shù)對與家兔皮膚真菌病形成相關(guān)的蛋白編碼基因和lncRNAs進行了分選鑒定及功能分析;最后,用β-glucan模擬真菌抗原感染家兔表皮角化細胞(keratinocytes,KC)以構(gòu)建家兔KC炎癥細胞模型,并利用RNAi技術(shù)和過表達技術(shù)分析JAK2-STAT3信號通路在β-glucan誘導(dǎo)的家兔KC炎癥細胞模型中對CXCL8、CXCL11和IL-1β分泌的影響。本研究的主要結(jié)果如下:(1)用1.0×10~6 CFU/mL濃度的須毛癬菌感染家兔背部皮膚后發(fā)現(xiàn),感染后的家兔皮膚表現(xiàn)出明顯的發(fā)紅、結(jié)痂、伴有鱗屑和皮膚潰爛等皮膚真菌病臨床癥狀;六胺銀染色發(fā)現(xiàn)感染部位皮膚有菌絲入侵;H.E.染色結(jié)果顯示感染部位皮膚出現(xiàn)局部角化不全、棘層肥厚,且乳頭層和網(wǎng)狀層有大量炎性細胞浸潤,說明本研究成功構(gòu)建了家兔須毛癬菌型皮膚真菌病模型。(2)在12個鏈特異性RNA-seq文庫中共鑒定出19,720個可靠的蛋白編碼基因,包括10,620個已知的蛋白編碼基因和9,100個新鑒定出的蛋白編碼基因。在TM組與NS組間共鑒定出292個差異表達的蛋白編碼基因(q0.05),其中227個在TM組中高表達,65個在TM中低表達,部分差異表達的蛋白編碼基因可能通過參與真菌識別、炎性反應(yīng)或營養(yǎng)性免疫(nutritional immunity)應(yīng)答須毛癬菌感染;GO富集分析表明差異表達蛋白編碼基因主要富集在免疫應(yīng)答(Immune response)、應(yīng)答外界刺激(Response to external stimulus)、炎性應(yīng)答(Inflammatory response)、防御應(yīng)答(Defense response)和應(yīng)答應(yīng)激(Response to stress)等生物學(xué)通路中。KEGG分析表明差異表達蛋白編碼基因主要富集在細胞因子間相互作用(Cytokine-cytokine receptor interaction)、TLR信號通路(Toll-like receptor signaling pathway)、NK細胞介導(dǎo)細胞毒性(Natural killer cell mediated cytotoxicity)、趨化因子信號通路(Chemokine signaling pathway)、TNF信號通路(TNF signaling pathway)和NF-kappa B信號通路(NF-kappa B signaling pathway)等信號通路中。(3)在12個鏈特異性RNA-seq文庫中共鑒定出5,883個lncRNAs,與已知蛋白編碼基因相比,本研究鑒定出的lncRNAs長度更短,外顯子數(shù)較少,外顯子長度較長。64個差異表達的lncRNAs中,43個在TM組中高表達,21個在TM組中低表達。共表達分析表明,32個差異表達的lncRNAs和96個蛋白編碼基因間存在107個高度相關(guān)(|r|0.8)的相互作用關(guān)系。GO富集分析表明相關(guān)的蛋白編碼基因主要富集在角蛋白絲(Keratin filament)、抗原結(jié)合(Antigen binding)、MHC蛋白復(fù)合物(MHC protein complex)、抗原加工和呈遞(Antigen processing and presentation)、IL-1受體結(jié)合(Interleukin-1 receptor binding)和免疫應(yīng)答(Immune response)等生物學(xué)通路上。KEGG Pathway富集分析發(fā)現(xiàn)相關(guān)的蛋白編碼基因顯著富集到抗原加工和呈遞(Antigen processing and presentation)、吞噬作用(Endocytosis)、Jak-Stat信號通路(Jak-Stat signaling pathway)和細胞因子受體相互作用(Cytokine-cytokine receptor interaction)等信號通路,暗示lncRNAs可通過與蛋白編碼基因共表達參與家兔皮膚真菌病的形成;MiRPara分析發(fā)現(xiàn),173個lncRNAs包含9,561個預(yù)測miRNAs的前體序列,其中641個miRNAs可靶向10個蛋白編碼基因。GO富集分析表明這些蛋白編碼基因主要富集到免疫系統(tǒng)過程(Immune system process)、應(yīng)答應(yīng)激(Response to stress)和應(yīng)答刺激(Response to stimulus)等可能與家兔皮膚真菌病相關(guān)的條目中,推測lncRNAs能通過被加工成miRNAs來參與家兔皮膚真菌病的形成。(4)用不同濃度β-glucan模擬真菌抗原刺激家兔KC后發(fā)現(xiàn),20μg/mLβ-glucan對KC的抑制率(IR)接近10%,可作為感染KC的最適濃度;用20μg/mLβ-glucan感染KC 24 h后,感染組KC中CXCL8、CXCL11和IL-1β分泌量明顯高于對照組,表明β-glucan誘導(dǎo)家兔KC炎癥細胞模型構(gòu)建成功。在KC炎癥細胞模型中發(fā)現(xiàn),β-glucan刺激能誘導(dǎo)JAK2 mRNA和p-STAT3表達;沉默JAK2的表達可抑制β-glucan誘導(dǎo)的p-STAT3表達和IL-1β分泌;過表達JAK2能進一步促進β-glucan對p-STAT3蛋白和IL-1β的誘導(dǎo)作用。說明β-glucan能通過激活JAK2/STAT3信號通路誘導(dǎo)IL-1β分泌,也說明KC中由JAK2/STAT3信號通路誘導(dǎo)分泌的IL-1β參與須毛癬菌感染家兔背部皮膚引起的炎癥。本研究在家兔皮膚真菌病疾病模型基礎(chǔ)上,篩選出了大量與家兔須毛癬菌型皮膚真菌病相關(guān)的蛋白編碼基因和lncRNAs,并在β-glucan誘導(dǎo)的KC炎癥細胞模型中對JAK2/STAT3信號通路和部分基因的作用進行探究,為深入揭示家兔皮膚真菌病形成的分子機制提供了理論基礎(chǔ),也為家兔皮膚真菌病的抗病育種提供參考依據(jù)。
【學(xué)位授予單位】：四川農(nóng)業(yè)大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2018
【分類號】：S858.291
【圖文】：

障、生化屏障和感知作用等；免疫功能包括維持機體自我耐受性、阻止過敏反應(yīng)和抑制自身免疫等[60]。1.3.2 皮膚的解剖學(xué)結(jié)構(gòu)皮膚功能多樣性與皮膚的解剖學(xué)結(jié)構(gòu)密切相關(guān)。皮膚主要由表皮和真皮構(gòu)成，中間被基膜隔開。表皮由下至上分別是基底層、棘層、顆粒層和角質(zhì)層，其中角質(zhì)層由角質(zhì)細胞（即死亡的表皮角化細胞）構(gòu)成，角質(zhì)細胞與皮膚中的汗液、脂類和抗菌肽聯(lián)合形成了皮膚的物理和生化屏障。表皮中的細胞成分主要有表皮角化細胞（keratinocytes，KC）、黑色素細胞、朗格漢斯細胞、T 細胞和神經(jīng)末梢細胞（亦作默克爾細胞）。真皮由外至內(nèi)分別為乳頭層和網(wǎng)狀層，主要包括血管和真皮樹突狀細胞、αβT 細胞、γδT 細胞、NK 細胞、B 細胞、肥大細胞和巨噬細胞等[60]（圖 1-1）。

25圖 2-1 RNA 質(zhì)檢和定量流程Fig. 2-1 The schedule of RNA quality check and quantification的檢測主要包括 4 各部分：糖凝膠電泳檢測 RNA 降解程度以及是否有污染；Photometer spectrophotometer 檢測 RNA 的純度（OD260t 2.0 Flurometer 對 RNA 濃度進行精確定量；nt 2100 精確檢測 RNA 的完整性。 文庫構(gòu)建和測序

（3）當單端測序 reads 中含有的低質(zhì)量（sQ≤5）堿基數(shù)超過該條 read 堿基0%時，去除此 paired-end reads。3.6 Hisat2 參考序列比對分析使用轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)比對軟件 Hisat2[182]將 clean reads 分別比對家兔轉(zhuǎn)錄本及參組（Oryctolagus_cuniculus.OryCun2.0.dna_sm.toplevel.fa）。該軟件首先給出兩索引的策略，BWT（Burrows-Wheeler Transform）和 FM（Ferragina-Manzin，而后在索引基礎(chǔ)上進行快速 Mapping 定位，發(fā)現(xiàn) Indel、SNP 等位點信息。H比目前其他 RNA-seq 分析軟件（如 Tophat2[183]）具有更高的準確率及搜索效軟件部分流程如圖 2-2。

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本文編號：2797899