【摘要】：雞傳染性支氣管炎(IB)是由禽傳染性支氣管炎病毒(IBV)引起雞的一種急性、高度接觸性傳染病。IBV M41株是IBV標準毒力株。雞胚腎(CEK)細胞來源于IBV易感宿主,能較好模擬IBV感染環(huán)境且同時具有較高的敏感性。CEK細胞作為一種宿主細胞模型,已經廣泛地被應用于研究IBV致病機制。細胞自噬和細胞凋亡是各類生物體內十分重要的生物學過程,兩者均積極地參與機體的發(fā)育和生長等過程。一直以來都有研究專注于病毒感染過程中自噬與凋亡所扮演的特殊角色。然而針對于IBV來講,自噬與凋亡的發(fā)生及其在病毒復制過程中起到何種關鍵作用至今未有系統性的深入研究。本試驗首先研究了IBV感染CEK細胞后是否發(fā)生自噬和凋亡,利用Western Blot、免疫熒光技術、實時熒光定量PCR和電鏡等方法進行相關檢測。結果表明,IBV感染CEK細胞后0-48 h內發(fā)生自噬和凋亡,自噬先升高后下降(30 h為轉折點),凋亡從30 h開始發(fā)生且持續(xù)升高,自噬和凋亡的發(fā)生有著一定的規(guī)律。Western Blot和病毒滴度試驗檢測自噬對病毒復制影響的結果顯示,在0-48 h之內激活自噬,病毒復制先增加后減少;抑制自噬的情況下,病毒復制先減少后增加,表明自噬先促進病毒復制后抑制病毒復制。凋亡對病毒復制影響的結果顯示,在30-48 h之內激活凋亡的情況下,病毒復制減少;抑制凋亡的情況下,病毒復制增加,表明凋亡抑制病毒復制。為了進一步研究自噬和凋亡是否相互作用從而影響病毒的復制,利用Western Blot和實時熒光定量PCR方法等進行相關檢測。結果顯示,在病毒感染30 h和36 h,激活自噬的情況下,凋亡增加,抑制自噬的情況下,凋亡減少;而激活或抑制凋亡的情況下,自噬基本無變化。而42 h和48 h處,激活凋亡的情況下,自噬減少,抑制凋亡的情況下,自噬增加;而激活或抑制自噬的情況下,凋亡基本無變化。表明自噬先主導促進凋亡,凋亡后主導抑制自噬;并且先是自噬對病毒復制的抑制作用強于凋亡,后來是凋亡對病毒復制的抑制作用強于自噬。綜上所述,IBV感染CEK細胞發(fā)生自噬和凋亡,自噬先促進病毒復制后抑制病毒復制,凋亡抑制病毒復制。并且自噬先主導促進凋亡從而抑制病毒復制,凋亡后主導抑制自噬也抑制病毒復制。
【學位授予單位】：東北農業(yè)大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2019
【分類號】：S858.31
【圖文】：

結 果 結果.1 IBV M41 株感染 CEK 細胞的建模.1.1 IBV M41 株感染 CEK 細胞用 100 倍 TCID50的 IBV（在 CEK 細胞上穩(wěn)定傳至第十代）感染 CEK 細胞后，在倒置鏡下觀察。結果如圖 3-1 所示，實驗組中 IBV 感染 CEK 細胞后，呈現出細胞由原本的不規(guī)則船帆形狀逐漸變圓、固縮、聚集成團、最后脫落。細胞對照組并無此變化。由此 IBV 可在 CEK 細胞上穩(wěn)定傳代，并發(fā)生典型的 CPE。

DNA 2000 Marker；2：IBV-NA 2000 Marker; 2: IBV-N; 感染 CEK 細胞的 RT-PR assay results of IBV-in病毒于 CEK 細胞 72 h 后計算病毒感染復數（M0 MOI 的 IBV 分別接種以觀察 IBV N 蛋白的表山羊抗兔 IgG，1：250表達量均顯著高于 0.1

選取0.1 MOI、1 MOI和10 MOI的IBV分別接種于CEK細胞于24 h后進行間接免疫熒光（IFA）實驗，以觀察病毒特異性熒光的表達情況。一抗選取IBV全病毒多抗，1：250倍稀釋；二抗選取FITC標記山羊抗兔IgG，1：2000倍稀釋。結果如圖3-4所示，1 MOI下的病毒特異性熒光最多最亮，顯著多于0.1 MOI和10 MOI，10 MOI可能由于病毒接種量太大導致部分細胞已經脫落死亡。綜合Western Blot和IFA的結果，后續(xù)實驗我們選取1 MOI進行病毒接種最為恰當。a24 h36 h0.1 MOI1.0 MOI10 MOI0.1 MOI1.0 MOI10 MOIIBV Nβ-actinb

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