【摘要】：坦布蘇病毒(Tembusu virus,TMUV)感染,是于2010年4月份發(fā)生在我國(guó)江浙地區(qū)的一種新發(fā)病毒性傳染病,其主要引起產(chǎn)蛋鴨體溫升高、食欲下降、卵泡變性出血、卵黃性腹膜炎、產(chǎn)蛋大幅下降以及雛鴨頭頸震顫、共濟(jì)失調(diào)和四肢麻痹等典型癥狀。該傳染病具有傳播范圍廣、傳播速度快以及感染率高等特點(diǎn)。至今,已造成我國(guó)大多數(shù)省份的養(yǎng)鴨場(chǎng)發(fā)生感染,嚴(yán)重影響著我國(guó)水禽養(yǎng)殖業(yè)的健康發(fā)展。深入探究病毒感染所誘導(dǎo)宿主細(xì)胞的生物學(xué)功能改變及有關(guān)信號(hào)通路網(wǎng)絡(luò)的調(diào)控機(jī)制,不僅有助于理解病毒在細(xì)胞內(nèi)、外的信號(hào)傳遞,以及轉(zhuǎn)錄后的調(diào)節(jié)過程,自身與其他信號(hào)分子之間的關(guān)系及相互作用,還可對(duì)宿主細(xì)胞代謝及相關(guān)疫病的發(fā)生發(fā)展過程有較為全面的認(rèn)識(shí)。然而,目前對(duì)于TMUV與其宿主細(xì)胞互作機(jī)制的研究甚少,對(duì)于該病毒所誘導(dǎo)宿主細(xì)胞生物學(xué)功能影響機(jī)制更是缺乏了解。為解決上述問題,本研究以鴨胚成纖維細(xì)胞(DEF)為研究對(duì)象,利用在流行病學(xué)調(diào)查中所分離的蚊源TMUV(TMUV-SDMS)作為國(guó)內(nèi)該病毒優(yōu)勢(shì)株的代表株,運(yùn)用轉(zhuǎn)錄組測(cè)序技術(shù)(RNA-Seq)、qRT-PCR和RNAi等分子生物學(xué)技術(shù),在細(xì)胞及分子水平上深入探究TMUV感染對(duì)DEF細(xì)胞生物學(xué)功能的影響,篩選并驗(yàn)證該病毒感染與宿主細(xì)胞互作的關(guān)鍵基因或蛋白,探討了TMUV-SDMS所誘導(dǎo)DEF凋亡與壞死的致死機(jī)理,為闡明該病毒逃逸宿主防御機(jī)制、探尋抗病毒新靶點(diǎn)等提供數(shù)據(jù)支持。研究?jī)?nèi)容主要分為以下五個(gè)方面:一、TMUV遺傳演化分析本項(xiàng)研究在流行病學(xué)調(diào)查中所分離到的11株TMUV分離株(包括鴨源、雞源、鵝源、麻雀源和蚊源)的基礎(chǔ)上,對(duì)NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)67株TMUV代表株的同源性比對(duì)、進(jìn)化樹分析、蛋白質(zhì)三級(jí)結(jié)構(gòu)和糖基化位點(diǎn)進(jìn)行了分析。結(jié)果表明:當(dāng)前我國(guó)已有17個(gè)省份出現(xiàn)了TMUV的感染,且該傳染病的爆發(fā)具有秋季高發(fā)的季節(jié)性特點(diǎn);由以上78株病毒代表株的同源性比對(duì)和進(jìn)化樹分析可知,該病毒NS1基因的核酸和氨基酸的同源性均明顯低于其E基因、NS3基因和NS5基因的核酸和氨基酸的同源性,TMUV主要演化為馬來西亞(1955)、馬來西亞(2012)、泰國(guó)(2013)和中國(guó)分離株I和中國(guó)分類株II(TMUV優(yōu)勢(shì)株)五大分支;根據(jù)以上病毒代表株蛋白質(zhì)高級(jí)結(jié)構(gòu)和糖基化位點(diǎn)分析,該病毒E蛋白在148~151處氨基酸位點(diǎn)存在著由無規(guī)則卷曲到α螺旋的變異,在380~381處和393~397處存在著β折疊片段的延長(zhǎng)的變異,在154處氨基酸糖基化位點(diǎn)存在著由NYSA到NYPV、NYSV和NYPA的突變;此外,該病毒NS1蛋白在180~182處氨基酸位點(diǎn)存在著由無規(guī)則卷曲到α螺旋的結(jié)構(gòu)變異,在175處氨基酸糖基化位點(diǎn)存在由NTTD到NITD的突變。以上結(jié)果表明,當(dāng)前我國(guó)TMUV優(yōu)勢(shì)株為中國(guó)分離株II,且總體變異程度較小;蚊源TMUV(TMUV-SDMS)可作為國(guó)內(nèi)TMUV優(yōu)勢(shì)株的代表株。二、TMUV-SDMS在DEF中的感染及樣品RNA-Seq分析本研究選用最早感染TMUV蚊源細(xì)胞(C6/36)對(duì)TMUV-SDMS進(jìn)行增殖培養(yǎng),隨后將增殖培養(yǎng)后的TMUV-SDMS接種至生長(zhǎng)密度為70%~80%的原代DEF中。將感染該病毒的DEF細(xì)胞和未感染該病毒的DEF細(xì)胞分別設(shè)為試驗(yàn)組和對(duì)照組,于感染后的12 h和24 h時(shí)分別提取總RNA,并對(duì)其進(jìn)行質(zhì)檢(A260/A2801.5,A260/A2301.0,RIN7)。運(yùn)用Illumina HiSeq 2000~(TM)平臺(tái)對(duì)以上樣品進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組測(cè)序(RNA-Seq),采用RPKM(Reads Per Kilobase of exon model per million mapped sequence reads)方法對(duì)Unigene進(jìn)行計(jì)算,按照表達(dá)量倍數(shù)變化(Fold Change)和表達(dá)量變化顯著性(P value)篩選Unique(差異基因的篩選標(biāo)準(zhǔn)為差異倍數(shù)Fold change2且P0.05)。最后,在全基因組背景下,運(yùn)用超幾何運(yùn)算將篩選出差異表達(dá)基因分別向GO功能分類和KEGG信號(hào)通路富集分析。結(jié)果顯示,經(jīng)過質(zhì)控后的各組樣品得到的clean data,Q20和Q30質(zhì)控率均在94.0%以上,由此表明本研究中所獲得的轉(zhuǎn)錄組測(cè)序數(shù)據(jù)質(zhì)量較高。在病毒感染12 h時(shí),共篩選出911個(gè)差異基因,其中83.96%(764/911)的差異基因上調(diào)表達(dá),16.04%的差異基因下調(diào)表達(dá)(147/911);在病毒感染24 h時(shí),共篩選出3008個(gè)差異基因,其中59.54%(1791/3008)的差異基因上調(diào)表達(dá),40.46%的差異基因下調(diào)表達(dá)(1217/3008)。通過對(duì)以上差異基因進(jìn)行GO功能分類和KEGG信號(hào)通路富集分析可知,這些差異基因行使的生物學(xué)功能主要為免疫系統(tǒng)、細(xì)胞生長(zhǎng)與壞死、信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)和信號(hào)分子與交互等方面。以上結(jié)果表明,TMUV-SDMS可誘導(dǎo)DEF免疫系統(tǒng)、細(xì)胞生長(zhǎng)與壞死、信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)和信號(hào)分子與交互等生物學(xué)功能的改變。三、TMUV-SDMS感染對(duì)DEF免疫系統(tǒng)的影響在本研究中,由RNA-Seq所提示的信息可知,免疫相關(guān)的差異基因主要富集在Toll樣受體信號(hào)通路、RIG-I-樣受體信號(hào)通路、趨化因子信號(hào)通路、NOD樣受體信號(hào)通路、造血細(xì)胞系、細(xì)胞質(zhì)DNA識(shí)別信號(hào)通路等。通過對(duì)以上信號(hào)通路中的差異基因按照表達(dá)量的高低進(jìn)行進(jìn)一步分類匯總可知,在TMUV-SDMS感染DEF早期和中期時(shí),宿主細(xì)胞內(nèi)與免疫相關(guān)信號(hào)通路中的模式識(shí)別受體(如RIG-I、MDA5和TMEM173)被激活,導(dǎo)致細(xì)胞因子(如IFNα、IL-6、IL-12、CCL19和CCL20),轉(zhuǎn)錄因子和信號(hào)分子(如IRF7、NF-kB和STAT1)和抗原呈遞蛋白(如CD44和CD70)的大量產(chǎn)生,由此初步揭示了宿主細(xì)胞應(yīng)對(duì)該病毒感染的天然免疫轉(zhuǎn)錄譜。四、TMUV-SDMS感染對(duì)DEF細(xì)胞凋亡與壞死影響結(jié)合RNA-Seq所提供的信息,本研究運(yùn)用激光共聚焦顯微鏡、流式細(xì)胞術(shù)和JC-1探針等技術(shù)定性和定量檢測(cè)了TMUV-SDMS感染對(duì)DEF細(xì)胞生長(zhǎng)與壞死的影響。結(jié)果顯示,TMUV-SDMS感染不僅可以導(dǎo)致DEF細(xì)胞在感染12 h和24 h后的細(xì)胞活性顯著降低(P0.01),還可以誘導(dǎo)DEF細(xì)胞顯著的凋亡與壞死、S+G2M期的停滯以及線粒體膜電位的降低(P0.05或P0.01)。通過對(duì)本研究中細(xì)胞凋亡與壞死相關(guān)差異基因的匯總分析可知,這些差異基因主要定位于內(nèi)源性的線粒體途徑和外源性的死亡受體途徑。以上結(jié)果表明,TMUV-SDMS感染可誘導(dǎo)DEF細(xì)胞S+G2/M期停滯,這可能是因CDC20B過表達(dá)所致;且該病毒感染主要是通過內(nèi)源性的線粒體途徑和外源性的死亡受體途徑誘導(dǎo)DEF凋亡與壞死。五、DEF細(xì)胞生長(zhǎng)與壞死關(guān)鍵基因的篩選與驗(yàn)證為了進(jìn)一步確定TMUV-SDMS與DEF互作的關(guān)鍵基因,闡明其在調(diào)節(jié)該病毒感染所誘導(dǎo)DEF細(xì)胞生長(zhǎng)與壞死過程中所行使生物學(xué)功能。本項(xiàng)研究根據(jù)RNA-Seq所提供的信息,選擇在細(xì)胞凋亡信號(hào)通路中表達(dá)量最高且具有調(diào)節(jié)線粒體膜通透性、控制CytC和凋亡因子釋放等作用的B淋巴細(xì)胞瘤2A1抗凋亡基因(BCL2A1)作為目的基因,運(yùn)用RNAi等分子生物學(xué)技術(shù)探究其在調(diào)節(jié)細(xì)胞周期、細(xì)胞凋亡與壞死等細(xì)胞生長(zhǎng)與壞死過程中的調(diào)節(jié)作用。研究結(jié)果表明,BCL2A1具有調(diào)控宿主細(xì)胞G2M期以及細(xì)胞凋亡和壞死作用;且該靶基因與BCL2、CDC20B和MCL1等還具有密切關(guān)系(即:與BCL2有拮抗作用,與CDC20B、CytC和MCL1等有協(xié)同關(guān)系),但具體作用機(jī)制還需今后進(jìn)一步探究。本研究從分子水平探討了TMUV感染對(duì)DEF細(xì)胞生物學(xué)功能的影響,深入揭示了該病毒所誘導(dǎo)DEF凋亡與壞死的具體機(jī)制,研究結(jié)果對(duì)于豐富TMUV感染宿主轉(zhuǎn)錄譜、闡明該病毒逃逸宿主防御機(jī)制和探尋靶向線粒體抗病毒藥物研發(fā)等均具有重要意義。
【學(xué)位授予單位】：山東農(nóng)業(yè)大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2019
【分類號(hào)】：S858.32
【圖文】：

2013）。該屬中的大多數(shù)黃病毒可按照血清學(xué)的方法分為 8 個(gè)的深入，發(fā)現(xiàn)也有部分黃病毒（如 YFV 等）無法根據(jù)血清學(xué)進(jìn)行分型（，這可能是由于該病毒分布廣泛、宿主種類繁多等因素所導(dǎo)致。另徑的不同，黃病毒屬的病毒可分為蜱媒病毒（Tick-borne viruses groosquito-borne viruses group）和未知媒介病毒類（Non-vector group）。病毒的形態(tài)結(jié)構(gòu) 具有典型的黃病毒形態(tài)特征：電鏡下，病毒為球形顆粒（直徑約為 45為對(duì)稱二十面體結(jié)構(gòu)的核衣殼蛋白（直徑約為 30 nm），為病毒基因 RNA；外層為脂質(zhì)囊膜包裹，且有糖蛋白組成的刺突（圖 1）（Heinz an

件中 Pearson’s 模塊對(duì) RNA-Seq 與 qPCR 部分差異基因的表達(dá)量進(jìn)行的相關(guān)性驗(yàn)證；顯著差異性水平為 p < 0.05（*）和 p < 0.01（**）；作圖軟件使用 GraphPad Prism 7 和 AdobeIllustrator CS6 等。3 結(jié)果及分析3.1 TMUV 遺傳演化分析3.1.1 TMUV 流行病學(xué)調(diào)查在本研究中，我們?cè)谌珖?guó) 17 個(gè)省份收集到 308 份疑似 TMUV 感染的病料，通過常規(guī) RT-PCR 檢測(cè)和 Sanger 測(cè)序驗(yàn)證，得到 212 份該病毒感染的陽(yáng)性樣品（圖 3）。該疫病在全國(guó)的流行分布如圖 3 所示，該病毒已由最初東南沿海地區(qū)蔓延至四川、重慶、湖北、內(nèi)蒙古等內(nèi)陸地區(qū)，現(xiàn)已造成我國(guó) 50 %的省市自治區(qū)（17/34）的養(yǎng)禽場(chǎng)發(fā)生感染。值得注意的是，該疫病的爆發(fā)呈現(xiàn)季節(jié)性規(guī)律，在秋季較為高發(fā)（圖 4）。

圖 4 TMUV 感染病例在一年四季的發(fā)病情況Figure 4 TMUV infection positive cases in four seasons化分析亞和我國(guó)大陸 78 株 TMUV 代表株的開放閱讀框（ORF）、因和 NS5 基因進(jìn)行進(jìn)化樹分析可知（圖 5，圖 6，圖 7，圖主要分為馬來西亞（1955）、馬來西亞（2012）、泰國(guó)（20分類株 II（TMUV 優(yōu)勢(shì)株）五大分支，且本研究所分離到的國(guó)分離株 II（TMUV 優(yōu)勢(shì)株）。

【參考文獻(xiàn)】

相關(guān)期刊論文 前9條

1 張丹俊;沈?qū)W懷;趙瑞宏;戴銀;胡曉苗;潘孝成;侯宏艷;周學(xué)利;朱傳民;;鴨坦布蘇病毒對(duì)產(chǎn)蛋雞的致病性研究[J];中國(guó)家禽;2015年13期

2 劉宇卓;宋子梁;李銀;黃欣梅;趙冬敏;韓凱凱;楊婧;;6日齡雛雞混合感染坦布蘇病毒和多殺性巴氏桿菌的病原學(xué)研究[J];江西農(nóng)業(yè)學(xué)報(bào);2015年04期

3 劉鑫;刁有祥;陳浩;王蛟;孫曉艷;葛平萍;郝東敏;;1株麻雀源坦布蘇病毒的分離鑒定及全基因組序列分析[J];中國(guó)獸醫(yī)學(xué)報(bào);2015年02期

4 陳珍;傅秋玲;施少華;陳紅梅;傅光華;程龍飛;萬春和;林建生;黃瑜;;我國(guó)部分地區(qū)雞感染禽坦布蘇病毒血清流行病學(xué)調(diào)查[J];福建農(nóng)業(yè)學(xué)報(bào);2014年01期

5 張敬峰;李銀;趙冬敏;黃欣梅;劉宇卓;鈕惠敏;;雞源坦布蘇病毒(SN01株)的分離與鑒定[J];浙江農(nóng)業(yè)學(xué)報(bào);2013年05期

6 張大丙;;鴨出血性卵巢炎的研究進(jìn)展[J];中國(guó)家禽;2011年14期

7 曹貞貞;張存;黃瑜;刁有祥;葉偉成;劉月煥;韓婧文;馬國(guó)明;張冬冬;許豐;王丹;姜甜甜;袁媛;謝小雨;高緒慧;唐熠;施少華;萬春和;張晨;何玢;楊夢(mèng)婕;陸新浩;張冰;張國(guó)中;馬學(xué)軍;張大丙;;鴨出血性卵巢炎的初步研究[J];中國(guó)獸醫(yī)雜志;2010年12期

8 李焱;時(shí)瑩;徐志凱;丁天兵;;登革病毒E蛋白入胞機(jī)制研究現(xiàn)狀[J];熱帶醫(yī)學(xué)雜志;2010年02期

9 周鵬程,陳建國(guó),丁明孝;黃病毒科病毒編碼的非結(jié)構(gòu)蛋白及其功能[J];微生物學(xué)免疫學(xué)進(jìn)展;1999年02期

本文編號(hào)：2797325