【摘要】：畜禽種質(zhì)資源是維持生態(tài)安全、農(nóng)業(yè)穩(wěn)定的重要資源,它推動著經(jīng)濟的繁榮與社會的進步。重要的家養(yǎng)動物種質(zhì)資源應(yīng)該受到重視,并得到有效的保護。間充質(zhì)干細胞可以在體外快速增殖并且可以向其他細胞分化。這些優(yōu)點使得它們成為畜禽種質(zhì)資源保存研究的新渠道。本實驗以肉雞真皮來源和鵝心臟來源的間充質(zhì)干細胞為實驗對象,在體外對細胞進行了分離培養(yǎng)、生物學(xué)特性研究和誘導(dǎo)分化研究,并得到以下結(jié)果:1.利用膠原酶Ⅰ和胰蛋白酶分離得到肉雞真皮間充質(zhì)干細胞(Dermal Mesenchymal Stem Cells,DMSCs),并在體外條件下培養(yǎng)31代,細胞形態(tài)主要為長梭形。RT-PCR鑒定結(jié)果顯示,細胞表達CD73、CD29、CD44,和CD71基因。免疫組織化學(xué)方法檢測結(jié)果顯示肉雞DMSCs陽性表達CD105、CD90、CD73和CD44表面標(biāo)記物。通過流式細胞儀分析,CD29、CD44和CD73在肉雞DMSCs中高表達。DMSCs的生長曲線為明顯的“S"形,與細胞在體外增殖的通常規(guī)律基本吻合。DMSCs的群體倍增時間和克隆形成能力的結(jié)果表明細胞的增殖能力隨著代次的升高而減弱。研究表明肉雞DMSCs能夠在一定的條件下被分化為成骨細胞、軟骨細胞和脂肪細胞,通過特異性染色和RT-PCR鑒定證明肉雞DMSCs向這三種細胞成功分化。2.利用膠原酶II和胰蛋白酶分離得到鵝心臟間充質(zhì)干細胞(Heart-derived Mesenchymal Stem Cells,HMSCs),并在體外培養(yǎng)21代,細胞形態(tài)特征呈現(xiàn)梭狀。RT-PCR和免疫組化檢測檢測結(jié)果都顯示細胞表達CD29,CD34,CD73,CD166和CD44等MSCs特異基因。通過流式細胞術(shù)分析,CD29,CD34,CD73,CD166和CD44在鵝HMSCs中高表達。HMSCs的生長曲線表明HMSCs經(jīng)過短暫潛伏期,進入迅速增殖的對數(shù)期,而后進入穩(wěn)定期和衰亡期,呈現(xiàn)出明顯的“S"形,與細胞體外生長的基本規(guī)律吻合。群體倍增時間結(jié)果表明HMSCs的增殖能力隨著代次的升高逐漸減弱。通過在培養(yǎng)基中加入適當(dāng)?shù)恼T導(dǎo)因子對HMSCs進行體外誘導(dǎo)分化實驗,通過特異性染色和RT-PCR等方法對實驗結(jié)果進行檢測。實驗結(jié)果表明,HMSCs成功被分化為成骨細胞、脂肪細胞和軟骨細胞,說明鵝HMSCs可以向多個方向誘導(dǎo)。綜上所述,本實驗成功分離培養(yǎng)了肉雞DMSCs和鵝HMSCs,并且對它們進行了生物學(xué)特性研究和誘導(dǎo)分化研究。結(jié)果顯示,肉雞DMSCs和鵝HMSCs均表現(xiàn)出MSCs特有的生物學(xué)特性。實驗結(jié)果對畜禽種質(zhì)資源保存具有重要的意義,并且為再生醫(yī)學(xué)和組織工程學(xué)提供了實驗依據(jù)。
【學(xué)位授予單位】：中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2018
【分類號】：Q813;S813
【圖文】：

加入阿利新藍染色觀察鈣結(jié)節(jié)的形成情況。同時提取兩組細胞的總 RNA-PCR 對 ACAN 這種特定基因進行檢測。特定基因引物序列見表 2.3。。阿利新藍染色：舍去原培養(yǎng)基，PBS 清洗 3 遍。舍去 PBS，加入 1mL 4 %多聚甲醛，固棄去固定液，PBS 清洗 3 次。舍去 PBS，加 2 mL 茜素紅染色液，室溫作用 30min。棄清洗 3 次。觀察細胞的染色情況，并拍照記錄。結(jié)果與分析 肉雞 DMSCs 的分離培養(yǎng).1 肉雞 DMSCs 的形態(tài)特征DMSCs 接種到 60 mm 培養(yǎng)皿中 24 h 之后，細胞成簇生長，折光性強，細胞生命力旺盛胞的形態(tài)大多數(shù)呈梭狀或多角形。長有細胞的地方，細胞密度較大，連接較為緊密。沒細胞的地方，細胞延展較好，形態(tài)較好觀察。培養(yǎng)皿中會混有死細胞和雜細胞，圖中發(fā)即為死細胞或未貼壁雜細胞。細胞數(shù)量符合傳代標(biāo)準(zhǔn)，遂進行傳代（圖 2.1A）。此時度不再過分緊湊，細胞易于觀察。形態(tài)也趨于均一，大多數(shù)為長梭形。仍有少數(shù)雜細胞亡的細胞。當(dāng) DMSCs 密度達到 80% ～ 90%時，進行細胞傳代（圖 2.1 B）。

Cellular morphology of DMSCs of P0-P31, respectively雞 DMSCs 的凍存情況MSCs 進行傳代培養(yǎng)的同時，也對細胞進行保存，按每凍存管 1×104個細胞進行凍存數(shù)量統(tǒng)計情況如表 2.4 所示。表 2.4 細胞凍存統(tǒng)計Table 2.4 Cellμlar cryopreservation代次 P3 P7 P9 P10 P13 P16 P19 P23 P25 P28 總計數(shù)量(管) 7 3 7 4 5 3 7 5 3 4 48雞 DMSCs 的生物學(xué)特性雞 DMSCs 的 RT-PCR 檢測測肉雞 DMSCs 表面標(biāo)記物。從 NCBI 系統(tǒng)中檢索了 GAPDH，CD29, CD44, CD73這些基因的編碼序列，并使用 primer5.0 進行特異性引物設(shè)計。RT-PCR 檢測結(jié)果表MSCs 表達 CD29, CD44, CD71 和 CD73 這些 MSCs 特異基因, Marker 為 DNA Ma)。

圖 2.2 DMSCs 不同代次的細胞形態(tài)(40x)Fig.2.2 The cell morphology of DMSCs in different generations (40x)分別是 DMSCs P0 到 P31 代細胞形態(tài)Cellular morphology of DMSCs of P0-P31, respectively2.2.1.2 肉雞 DMSCs 的凍存情況對 DMSCs 進行傳代培養(yǎng)的同時，也對細胞進行保存，按每凍存管 1×104個細胞進行凍存，DMSCs 保存數(shù)量統(tǒng)計情況如表 2.4 所示。表 2.4 細胞凍存統(tǒng)計Table 2.4 Cellμlar cryopreservation代次 P3 P7 P9 P10 P13 P16 P19 P23 P25 P28 總計數(shù)量(管) 7 3 7 4 5 3 7 5 3 4 482.2.2 肉雞 DMSCs 的生物學(xué)特性2.2.2.1 肉雞 DMSCs 的 RT-PCR 檢測檢測肉雞 DMSCs 表面標(biāo)記物。從 NCBI 系統(tǒng)中檢索了 GAPDH，CD29, CD44, CD73 和

【參考文獻】

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1 張浩;廖偉雄;李冀;劉元林;張毅;朱恒;李眾利;;兔骨髓栓來源的間充質(zhì)干細胞的分離培養(yǎng)及其生物學(xué)特性的研究[J];中國實驗血液學(xué)雜志;2015年02期

2 趙娜;;脂肪干細胞誘導(dǎo)分化的現(xiàn)狀及前景[J];中國組織工程研究;2015年06期

3 楊少光;邢文;田X;劉蒙;盧士紅;趙欽軍;任紅英;龐愛明;池穎;馬鳳霞;韓忠朝;;胎兒真皮間充質(zhì)干細胞中的全能性相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子的表達[J];中國組織工程研究與臨床康復(fù);2011年32期

4 魏開鵬;潘興南;王崇國;;兩種成人骨髓間充質(zhì)干細胞體外分離方法的比較研究[J];實用肝臟病雜志;2011年02期

5 官立萍;余杰;黃冰;羅挺;黃健發(fā);劉茜;林麗萍;張敏;李凱婧;陳系古;;人皮膚源性間充質(zhì)干細胞體外誘導(dǎo)向淋巴細胞分化的可能性(英文)[J];中國組織工程研究與臨床康復(fù);2010年19期

6 唐文潔;李瑪琳;邱垂源;陳瓊玉;李國輝;李凌松;洪岸;;FGF-2對人骨髓間充質(zhì)干細胞增殖和向成骨細胞分化的影響[J];細胞生物學(xué)雜志;2005年06期

7 黃維清,于建憲;CD105的分子結(jié)構(gòu)及其分布[J];齊魯醫(yī)學(xué)雜志;2005年03期

8 史春夢,程天民;大鼠真皮多能間充質(zhì)干細胞的分離培養(yǎng)[J];第三軍醫(yī)大學(xué)學(xué)報;2001年09期

9 吳常信;畜禽遺傳資源保存的理論與技術(shù)[J];家畜生態(tài);2001年01期

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1 崔鵬;綿羊真皮間充質(zhì)干/祖細胞的分離培養(yǎng)及生物學(xué)特性研究[D];中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院;2014年

2 牛云飛;表皮干細胞的體表分布及其分離、培養(yǎng)和鑒定[D];第二軍醫(yī)大學(xué);2004年

本文編號：2797236