【摘要】：畜禽種質資源是維持生態(tài)安全、農業(yè)穩(wěn)定的重要資源,它推動著經濟的繁榮與社會的進步。重要的家養(yǎng)動物種質資源應該受到重視,并得到有效的保護。間充質干細胞可以在體外快速增殖并且可以向其他細胞分化。這些優(yōu)點使得它們成為畜禽種質資源保存研究的新渠道。本實驗以肉雞真皮來源和鵝心臟來源的間充質干細胞為實驗對象,在體外對細胞進行了分離培養(yǎng)、生物學特性研究和誘導分化研究,并得到以下結果:1.利用膠原酶Ⅰ和胰蛋白酶分離得到肉雞真皮間充質干細胞(Dermal Mesenchymal Stem Cells,DMSCs),并在體外條件下培養(yǎng)31代,細胞形態(tài)主要為長梭形。RT-PCR鑒定結果顯示,細胞表達CD73、CD29、CD44,和CD71基因。免疫組織化學方法檢測結果顯示肉雞DMSCs陽性表達CD105、CD90、CD73和CD44表面標記物。通過流式細胞儀分析,CD29、CD44和CD73在肉雞DMSCs中高表達。DMSCs的生長曲線為明顯的“S"形,與細胞在體外增殖的通常規(guī)律基本吻合。DMSCs的群體倍增時間和克隆形成能力的結果表明細胞的增殖能力隨著代次的升高而減弱。研究表明肉雞DMSCs能夠在一定的條件下被分化為成骨細胞、軟骨細胞和脂肪細胞,通過特異性染色和RT-PCR鑒定證明肉雞DMSCs向這三種細胞成功分化。2.利用膠原酶II和胰蛋白酶分離得到鵝心臟間充質干細胞(Heart-derived Mesenchymal Stem Cells,HMSCs),并在體外培養(yǎng)21代,細胞形態(tài)特征呈現(xiàn)梭狀。RT-PCR和免疫組化檢測檢測結果都顯示細胞表達CD29,CD34,CD73,CD166和CD44等MSCs特異基因。通過流式細胞術分析,CD29,CD34,CD73,CD166和CD44在鵝HMSCs中高表達。HMSCs的生長曲線表明HMSCs經過短暫潛伏期,進入迅速增殖的對數(shù)期,而后進入穩(wěn)定期和衰亡期,呈現(xiàn)出明顯的“S"形,與細胞體外生長的基本規(guī)律吻合。群體倍增時間結果表明HMSCs的增殖能力隨著代次的升高逐漸減弱。通過在培養(yǎng)基中加入適當?shù)恼T導因子對HMSCs進行體外誘導分化實驗,通過特異性染色和RT-PCR等方法對實驗結果進行檢測。實驗結果表明,HMSCs成功被分化為成骨細胞、脂肪細胞和軟骨細胞,說明鵝HMSCs可以向多個方向誘導。綜上所述,本實驗成功分離培養(yǎng)了肉雞DMSCs和鵝HMSCs,并且對它們進行了生物學特性研究和誘導分化研究。結果顯示,肉雞DMSCs和鵝HMSCs均表現(xiàn)出MSCs特有的生物學特性。實驗結果對畜禽種質資源保存具有重要的意義,并且為再生醫(yī)學和組織工程學提供了實驗依據。
【學位授予單位】：中國農業(yè)科學院
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2018
【分類號】：Q813;S813
【圖文】：

加入阿利新藍染色觀察鈣結節(jié)的形成情況。同時提取兩組細胞的總 RNA-PCR 對 ACAN 這種特定基因進行檢測。特定基因引物序列見表 2.3。。阿利新藍染色：舍去原培養(yǎng)基，PBS 清洗 3 遍。舍去 PBS，加入 1mL 4 %多聚甲醛，固棄去固定液，PBS 清洗 3 次。舍去 PBS，加 2 mL 茜素紅染色液，室溫作用 30min。棄清洗 3 次。觀察細胞的染色情況，并拍照記錄。結果與分析 肉雞 DMSCs 的分離培養(yǎng).1 肉雞 DMSCs 的形態(tài)特征DMSCs 接種到 60 mm 培養(yǎng)皿中 24 h 之后，細胞成簇生長，折光性強，細胞生命力旺盛胞的形態(tài)大多數(shù)呈梭狀或多角形。長有細胞的地方，細胞密度較大，連接較為緊密。沒細胞的地方，細胞延展較好，形態(tài)較好觀察。培養(yǎng)皿中會混有死細胞和雜細胞，圖中發(fā)即為死細胞或未貼壁雜細胞。細胞數(shù)量符合傳代標準，遂進行傳代（圖 2.1A）。此時度不再過分緊湊，細胞易于觀察。形態(tài)也趨于均一，大多數(shù)為長梭形。仍有少數(shù)雜細胞亡的細胞。當 DMSCs 密度達到 80% ～ 90%時，進行細胞傳代（圖 2.1 B）。

Cellular morphology of DMSCs of P0-P31, respectively雞 DMSCs 的凍存情況MSCs 進行傳代培養(yǎng)的同時，也對細胞進行保存，按每凍存管 1×104個細胞進行凍存數(shù)量統(tǒng)計情況如表 2.4 所示。表 2.4 細胞凍存統(tǒng)計Table 2.4 Cellμlar cryopreservation代次 P3 P7 P9 P10 P13 P16 P19 P23 P25 P28 總計數(shù)量(管) 7 3 7 4 5 3 7 5 3 4 48雞 DMSCs 的生物學特性雞 DMSCs 的 RT-PCR 檢測測肉雞 DMSCs 表面標記物。從 NCBI 系統(tǒng)中檢索了 GAPDH，CD29, CD44, CD73這些基因的編碼序列，并使用 primer5.0 進行特異性引物設計。RT-PCR 檢測結果表MSCs 表達 CD29, CD44, CD71 和 CD73 這些 MSCs 特異基因, Marker 為 DNA Ma)。

圖 2.2 DMSCs 不同代次的細胞形態(tài)(40x)Fig.2.2 The cell morphology of DMSCs in different generations (40x)分別是 DMSCs P0 到 P31 代細胞形態(tài)Cellular morphology of DMSCs of P0-P31, respectively2.2.1.2 肉雞 DMSCs 的凍存情況對 DMSCs 進行傳代培養(yǎng)的同時，也對細胞進行保存，按每凍存管 1×104個細胞進行凍存，DMSCs 保存數(shù)量統(tǒng)計情況如表 2.4 所示。表 2.4 細胞凍存統(tǒng)計Table 2.4 Cellμlar cryopreservation代次 P3 P7 P9 P10 P13 P16 P19 P23 P25 P28 總計數(shù)量(管) 7 3 7 4 5 3 7 5 3 4 482.2.2 肉雞 DMSCs 的生物學特性2.2.2.1 肉雞 DMSCs 的 RT-PCR 檢測檢測肉雞 DMSCs 表面標記物。從 NCBI 系統(tǒng)中檢索了 GAPDH，CD29, CD44, CD73 和

【參考文獻】

相關期刊論文 前9條

1 張浩;廖偉雄;李冀;劉元林;張毅;朱恒;李眾利;;兔骨髓栓來源的間充質干細胞的分離培養(yǎng)及其生物學特性的研究[J];中國實驗血液學雜志;2015年02期

2 趙娜;;脂肪干細胞誘導分化的現(xiàn)狀及前景[J];中國組織工程研究;2015年06期

3 楊少光;邢文;田X;劉蒙;盧士紅;趙欽軍;任紅英;龐愛明;池穎;馬鳳霞;韓忠朝;;胎兒真皮間充質干細胞中的全能性相關轉錄因子的表達[J];中國組織工程研究與臨床康復;2011年32期

4 魏開鵬;潘興南;王崇國;;兩種成人骨髓間充質干細胞體外分離方法的比較研究[J];實用肝臟病雜志;2011年02期

5 官立萍;余杰;黃冰;羅挺;黃健發(fā);劉茜;林麗萍;張敏;李凱婧;陳系古;;人皮膚源性間充質干細胞體外誘導向淋巴細胞分化的可能性(英文)[J];中國組織工程研究與臨床康復;2010年19期

6 唐文潔;李瑪琳;邱垂源;陳瓊玉;李國輝;李凌松;洪岸;;FGF-2對人骨髓間充質干細胞增殖和向成骨細胞分化的影響[J];細胞生物學雜志;2005年06期

7 黃維清,于建憲;CD105的分子結構及其分布[J];齊魯醫(yī)學雜志;2005年03期

8 史春夢,程天民;大鼠真皮多能間充質干細胞的分離培養(yǎng)[J];第三軍醫(yī)大學學報;2001年09期

9 吳常信;畜禽遺傳資源保存的理論與技術[J];家畜生態(tài);2001年01期

相關碩士學位論文 前2條

1 崔鵬;綿羊真皮間充質干/祖細胞的分離培養(yǎng)及生物學特性研究[D];中國農業(yè)科學院;2014年

2 牛云飛;表皮干細胞的體表分布及其分離、培養(yǎng)和鑒定[D];第二軍醫(yī)大學;2004年

本文編號：2797236