發(fā)布時(shí)間：2020-08-18 20:03

【摘要】：豬卵母細(xì)胞和胚胎的體外培養(yǎng)技術(shù)被廣泛用于研究胚胎發(fā)育的機(jī)制和動(dòng)物生殖技術(shù)。氧化應(yīng)激是影響卵母細(xì)胞質(zhì)量和胚胎發(fā)育的重要因素,因此減少卵母細(xì)胞及胚胎中的氧化應(yīng)激在研究胚胎發(fā)育的機(jī)制和動(dòng)物生殖技術(shù)中有重要意義。本研究旨在探究?jī)煞N抗氧化劑海帶多糖(LAM),山柰酚(KAE)在豬卵母細(xì)胞老化和早期胚胎發(fā)育的影響。主要分為以下四個(gè)試驗(yàn):試驗(yàn)一:LAM對(duì)豬老化卵母細(xì)胞的影響LAM是一種具有良好生物相容性的葡聚糖混合物,可作為食品添加劑和營(yíng)養(yǎng)保健品使用,有提高生長(zhǎng)性能和免疫應(yīng)答的作用。本研究旨在探討LAM對(duì)豬卵母細(xì)胞老化的影響。發(fā)現(xiàn)20μg/mLLAM延緩了卵母細(xì)胞老化過(guò)程,提高了老化卵母細(xì)胞的質(zhì)量。體外老化過(guò)程中,在IVM中添加LAM增強(qiáng)了老化卵母細(xì)胞的后續(xù)發(fā)育能力。卵母細(xì)胞老化24小時(shí)后,LAM處理組相比老化組可以顯著提高隨后胚胎發(fā)育的囊胚率(P0.01),調(diào)節(jié)細(xì)胞凋亡相關(guān)基因Bax和Caspase-3的mRNA轉(zhuǎn)錄水平顯著降低(P0.01)。與老化組相比,LAM處理組卵母細(xì)胞內(nèi)活性氧含量顯著降低(P0.01),谷胱甘肽含量顯著升高(P0.01),線粒體膜電位顯著升高(P0.01),Caspase-3和組織蛋白酶B活性顯著降低(P0.01)。綜上所述,這些結(jié)果表明LAM可以有效延緩豬卵母細(xì)胞老化,提高老化卵母細(xì)胞質(zhì)量。試驗(yàn)二:LAM對(duì)豬胚胎發(fā)育的影響本研究旨在探討LAM對(duì)豬早期胚胎發(fā)育的影響及其機(jī)制。結(jié)果表明,體外培養(yǎng)期間,在IVC中添加LAM后,豬早期胚胎的發(fā)育能力顯著提高。體外培養(yǎng)期間20μg/mLLAM的處理組,與對(duì)照組相比,顯著提高了胚胎的卵裂率(P0.01)、囊胚率(P0.01)、孵化率(P0.05)和囊胚內(nèi)總細(xì)胞數(shù)(P0.01)。值得注意的是,LAM降低了 H202誘導(dǎo)的細(xì)胞內(nèi)活性氧生成(P0.01)。同時(shí)LAM提高了細(xì)胞內(nèi)谷胱甘肽水平和線粒體膜電位極性(P0.05)。此外,在豬胚胎早期發(fā)育階段添加LAM后,合子基因組活化相關(guān)基因(Yap1)、多能性相關(guān)基因(Oct4、Nanog、Sox2)、孵化相關(guān)基因(Cox2、Gata4、Itga5)表達(dá)上調(diào)(P0.05)。這些結(jié)果表明,LAM通過(guò)降低豬早期胚胎內(nèi)氧化應(yīng)激水平進(jìn)而促進(jìn)胚胎發(fā)育。試驗(yàn)三:KAE對(duì)豬老化卵母細(xì)胞的影響KAE是最常見的膳食黃酮醇之一。存在于不同的植物物種中,具有抗炎、抗氧化和抗癌的治療作用。本研究主要探究在IVM中添加KAE對(duì)老化豬卵母細(xì)胞的影響及其機(jī)制。結(jié)果表明,0.1μM KAE可維持老化卵母細(xì)胞的質(zhì)量,增強(qiáng)老化卵母細(xì)胞的發(fā)育潛能,延緩卵母細(xì)胞老化。老化24小時(shí)的卵母細(xì)胞發(fā)育成囊胚后,KAE處理組相比老化未處理組囊胚率顯著提高(P0.05)。并且KAE處理組卵母細(xì)胞發(fā)育成囊胚后,囊胚中的胚胎多能性相關(guān)基因、Oct4、Nanog、Itga5的mRNA轉(zhuǎn)錄水平顯著升高(P0.05)。KAE處理后的老化卵母細(xì)胞相比老化未處理的卵母細(xì)胞顯著增加了線粒體膜電位極性(P0.05),降低細(xì)胞內(nèi)凋亡指數(shù)(P0.05)和活性氧含量(P0.05)。因此本研究結(jié)果表明,KAE可以通過(guò)降低氧化應(yīng)激和改善線粒體功能來(lái)延緩豬卵母細(xì)胞的老化。試驗(yàn)四:KAE對(duì)豬胚胎發(fā)育的影響本研究探討了在IVC中添加KAE對(duì)豬早期胚胎體外損傷的影響。在IVC中添加不同濃度的KAE,探究KAE對(duì)胚胎發(fā)育的影響。結(jié)果表明,添加0.1μMKAE顯著提高囊胚率(P0.05),并且0.11μM KAE可以緩解200μM H2O2處理后的胚胎質(zhì)量下降和囊胚率降低(P0.05)。KAE緩解了H2O2誘導(dǎo)的線粒體膜電位極性降低和活性氧的生成(P0.05)。此外,與對(duì)照組相比,H2O2誘導(dǎo)的氧化損傷組通過(guò)添加KAE可以減少囊胚內(nèi)自噬水平(P0.05)和DNA損傷的程度(P0.05)。這些結(jié)果表明,KAE通過(guò)降低氧化應(yīng)激和增強(qiáng)線粒體功能,對(duì)豬孤雌胚胎的發(fā)育有一定的促進(jìn)作用。綜上所示,本研究表明LAM可以有效延緩卵母細(xì)胞老化,增強(qiáng)老化卵母細(xì)胞發(fā)育潛能,提高豬胚胎的體外發(fā)育率;KAE可以維持老化卵母細(xì)胞質(zhì)量,延緩卵母細(xì)胞老化,有效緩解H2O2引起的早期胚胎的氧化損傷,對(duì)豬胚胎發(fā)育起到促進(jìn)的作用。
【學(xué)位授予單位】：延邊大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2019
【分類號(hào)】：S828
【圖文】：

為了確定ＬＡＭ是否能提高老化卵母細(xì)胞囊胚率和囊胚質(zhì)量，對(duì)成熟卵逡逑母細(xì)胞進(jìn)行孤雌激活。通過(guò)劑量試驗(yàn)研究，選擇囊胚率最高的ＬＡＭ劑量，逡逑作為最佳ＬＡＭ濃度。最終濃度為２０邋ｐｇ／ｍｌ邋ＬＡＭ，并用于后續(xù)研宄（圖２．１．Ａ）。逡逑孤雌激活后，對(duì)照組卵母細(xì)胞（體外培養(yǎng)不需額外培養(yǎng)２４小時(shí)）囊胚率為逡逑５６．７３±１．２３％。而老化２４小時(shí)卵母細(xì)胞囊胚率僅為２８．６８±邋１．９７％。但是添逡逑加２０邋ｎｇ／ｍｌ邋ＬＡＭ后老化２４小時(shí)的卵母細(xì)胞囊胚率為４５．３３±２．０５％，相比老逡逑化未添加ＬＡＭ組囊胚率顯著增加（Ｐ＜邋０．０１）。逡逑探究ＬＡＭ對(duì)老化卵母細(xì)胞發(fā)育的影響，統(tǒng)計(jì)了新鮮和老化卵母細(xì)胞發(fā)逡逑育的囊胚內(nèi)細(xì)胞總數(shù)（圖２．１．Ｂ和Ｃ）。老化２４小時(shí)后的卵母細(xì)胞發(fā)育成囊胚逡逑后細(xì)胞總數(shù)顯著低于新鮮卵母細(xì)胞發(fā)育成囊胚后的細(xì)胞總數(shù)。老化后的卵逡逑母細(xì)胞中，ＬＡＭ處理組相比老化組顯著增加了囊胚內(nèi)總細(xì)胞數(shù)。為了進(jìn)一逡逑步確定ＬＡＭ對(duì)凋亡相關(guān)基因表達(dá)的影響，測(cè)量了各組囊胚中Ｃａｓｐａｓｅ－３、逡逑Ｂａｘ、Ｂｃｌ－２基因的ｍＲＮＡ表達(dá)水平（圖２．１．邋Ｄ）。老化卵母細(xì)胞發(fā)育成囊胚后逡逑Ｃａｓｐａｓｅ－３和Ｂａｘ的表達(dá)水平顯著高于新鮮卵母細(xì)胞組。然而，ＬＡＭ處理組逡逑降低了老化卵母細(xì)胞發(fā)育成囊胚后Ｃａｓｐａｓｅ－３和Ｂａｘ基因的表達(dá)（Ｆ＜邋０．０１）。逡逑在老化后的卵母細(xì)胞中，ＬＡＭ處理組的卵母細(xì)胞與未處理組相比，Ｂｃｌ－２逡逑轉(zhuǎn)錄水平無(wú)顯著差異（尸＞邋０．０５）。逡逑１５逡逑

逡逑圖２．４邋ＬＡＭ對(duì)老化卵母細(xì)胞組織蛋白酶Ｂ活性的影響。（Ａ）具有代表性的圖像顯示逡逑組織蛋白酶Ｂ在卵母細(xì)胞中的活性，標(biāo)尺：１０0Ｐｍ。（Ｂ）相對(duì)定量檢測(cè)卵母細(xì)胞組織逡逑蛋白酶Ｂ的熒光強(qiáng)度顯，Ｒ邋＝邋３。逡逑Ｆｉｇｕｒｅ．２．４．邋Ｔｈｅ邋ｅｆｆｅｃｔ邋ｏｆ邋ＬＡＭ邋ｏｎ邋ｃａｔｈｅｐｓｉｎ邋Ｂ邋ａｃｔｉｖｉｔｙ邋ｏｆ邋ａｇｅｄ邋ｏｏｃｙｔｅｓ．邋（Ａ）逡逑Ｒｅｐｒｅｓｅｎｔａｔｉｖｅ邋ｉｍａｇｅｓ邋ｓｈｏｗｉｎｇ邋ｃａｔｈｅｐｓｉｎ邋Ｂ邋ａｃｔｉｖｉｔｙ邋ｉｎ邋ｆｒｅｓｈ，邋ａｇｅｄ，邋ａｎｄ邋ＬＡＭ－ｔｒｅａｔｅｄ邋Ｍｉｌ逡逑ｏｏｃｙｔｅｓ．邋Ｓｃａｌｅ邋ｂａｒ：邋１００邋｜ｉｍ．邋（Ｂ）邋Ｑｕａｎｔｉｆｉｅｄ邋ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ邋ｉｎｔｅｎｓｉｔｙ邋ｆｏｒ邋ｃａｔｈｅｐｓｉｎ邋Ｂ邋ｉｎ逡逑ｏｏｃｙｔｅｓ．邋Ｒ＝３．逡逑Ａ逡逑Ｆｒｅｓｈ邐Ａｇｅｄ邐Ａｇｅｄ＋ＬＡＭ逡逑煖幽逡逑Ｂ逡逑ｋ邋２．５－，逡逑！邋２．０－邐Ａ逡逑Ｃ逡逑名‘邋１＞邐－１－邐？逡逑ｃ逡逑１．０－逡逑Ｓ邋０．５邋■丨■ｊＵｐ１逡逑三邋0．0邋Ｊ＿＾邐邋－邋．ｊ邐邋一；一．「：．一ｓ逡逑ｒｊｍ邐Ｆｒｅｓｈ邐Ａｇｅｄ邋Ａｇｅｄ＋ＬＡＭ逡逑圖２．５邋ＬＡＭ對(duì)老化卵母細(xì)胞ｃａｓｐａｓｅ－３活性的影響。（Ａ）表示卵母細(xì)胞中ｃａｓｐａｓｅ－３逡逑活性

３．２．１邋ＩＶＣ期間添加ＬＡＭ對(duì)豬早期胚胎發(fā)育能力的影響逡逑在ＩＶＣ培養(yǎng)基中添加２０邋ｎｇ／ｍＬ邋ＬＡＭ，檢測(cè)ＬＡＭ對(duì)孤雌激活胚胎發(fā)育逡逑的影響。如圖３．１所示，ＬＡＭ處理組相比對(duì)照組顯著提高了卵裂率（７９．９３逡逑±１．１６％ｖｓ８７．５１±０．７４％，Ｐ＜０．０１）。ＬＡＭ處理組相比對(duì)照組顯著提高了逡逑第五天囊胚率２邋（８．８７邋±１．９９％邋ｖｓ邋３５．３１邋±１．８１％，尸＜０．０１），第六天囊胚逡逑率（３６．８８邋±邋２．８７％邋ｖｓ邋４７．９１邋±邋４．５７％，尸邋＜邋０．０１邋）和第七天囊胚率（４３．５３邋±邋１．３３％逡逑ｖｓ邋５６．０４邋±３．９９％，尸＜０．０１）。ＬＡＭ處理組與對(duì)照組相比第五天囊胚的孵逡逑化率無(wú)顯著差異（２．８５±３．２５％ｖｓ６．８８±２．４９，尸＞０．０５），但是ＬＡＭ處理逡逑組相比對(duì)照組顯著提高了第六天囊胚孵化率（８．８３邋±邋２．７２％邋ｖｓ邋２２．５３邋±邋１．８０，逡逑尸邋＜０．０１）和第七天囊胚孵化率（２１．４１邋±４．４１％邋ｖｓ邋３３．６３邋±４．１９％，尸＜邋０．０５）。逡逑結(jié)果顯示

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本文編號(hào)：2796657