【摘要】：豬卵母細胞和胚胎的體外培養(yǎng)技術被廣泛用于研究胚胎發(fā)育的機制和動物生殖技術。氧化應激是影響卵母細胞質量和胚胎發(fā)育的重要因素,因此減少卵母細胞及胚胎中的氧化應激在研究胚胎發(fā)育的機制和動物生殖技術中有重要意義。本研究旨在探究兩種抗氧化劑海帶多糖(LAM),山柰酚(KAE)在豬卵母細胞老化和早期胚胎發(fā)育的影響。主要分為以下四個試驗:試驗一:LAM對豬老化卵母細胞的影響LAM是一種具有良好生物相容性的葡聚糖混合物,可作為食品添加劑和營養(yǎng)保健品使用,有提高生長性能和免疫應答的作用。本研究旨在探討LAM對豬卵母細胞老化的影響。發(fā)現20μg/mLLAM延緩了卵母細胞老化過程,提高了老化卵母細胞的質量。體外老化過程中,在IVM中添加LAM增強了老化卵母細胞的后續(xù)發(fā)育能力。卵母細胞老化24小時后,LAM處理組相比老化組可以顯著提高隨后胚胎發(fā)育的囊胚率(P0.01),調節(jié)細胞凋亡相關基因Bax和Caspase-3的mRNA轉錄水平顯著降低(P0.01)。與老化組相比,LAM處理組卵母細胞內活性氧含量顯著降低(P0.01),谷胱甘肽含量顯著升高(P0.01),線粒體膜電位顯著升高(P0.01),Caspase-3和組織蛋白酶B活性顯著降低(P0.01)。綜上所述,這些結果表明LAM可以有效延緩豬卵母細胞老化,提高老化卵母細胞質量。試驗二:LAM對豬胚胎發(fā)育的影響本研究旨在探討LAM對豬早期胚胎發(fā)育的影響及其機制。結果表明,體外培養(yǎng)期間,在IVC中添加LAM后,豬早期胚胎的發(fā)育能力顯著提高。體外培養(yǎng)期間20μg/mLLAM的處理組,與對照組相比,顯著提高了胚胎的卵裂率(P0.01)、囊胚率(P0.01)、孵化率(P0.05)和囊胚內總細胞數(P0.01)。值得注意的是,LAM降低了 H202誘導的細胞內活性氧生成(P0.01)。同時LAM提高了細胞內谷胱甘肽水平和線粒體膜電位極性(P0.05)。此外,在豬胚胎早期發(fā)育階段添加LAM后,合子基因組活化相關基因(Yap1)、多能性相關基因(Oct4、Nanog、Sox2)、孵化相關基因(Cox2、Gata4、Itga5)表達上調(P0.05)。這些結果表明,LAM通過降低豬早期胚胎內氧化應激水平進而促進胚胎發(fā)育。試驗三:KAE對豬老化卵母細胞的影響KAE是最常見的膳食黃酮醇之一。存在于不同的植物物種中,具有抗炎、抗氧化和抗癌的治療作用。本研究主要探究在IVM中添加KAE對老化豬卵母細胞的影響及其機制。結果表明,0.1μM KAE可維持老化卵母細胞的質量,增強老化卵母細胞的發(fā)育潛能,延緩卵母細胞老化。老化24小時的卵母細胞發(fā)育成囊胚后,KAE處理組相比老化未處理組囊胚率顯著提高(P0.05)。并且KAE處理組卵母細胞發(fā)育成囊胚后,囊胚中的胚胎多能性相關基因、Oct4、Nanog、Itga5的mRNA轉錄水平顯著升高(P0.05)。KAE處理后的老化卵母細胞相比老化未處理的卵母細胞顯著增加了線粒體膜電位極性(P0.05),降低細胞內凋亡指數(P0.05)和活性氧含量(P0.05)。因此本研究結果表明,KAE可以通過降低氧化應激和改善線粒體功能來延緩豬卵母細胞的老化。試驗四:KAE對豬胚胎發(fā)育的影響本研究探討了在IVC中添加KAE對豬早期胚胎體外損傷的影響。在IVC中添加不同濃度的KAE,探究KAE對胚胎發(fā)育的影響。結果表明,添加0.1μMKAE顯著提高囊胚率(P0.05),并且0.11μM KAE可以緩解200μM H2O2處理后的胚胎質量下降和囊胚率降低(P0.05)。KAE緩解了H2O2誘導的線粒體膜電位極性降低和活性氧的生成(P0.05)。此外,與對照組相比,H2O2誘導的氧化損傷組通過添加KAE可以減少囊胚內自噬水平(P0.05)和DNA損傷的程度(P0.05)。這些結果表明,KAE通過降低氧化應激和增強線粒體功能,對豬孤雌胚胎的發(fā)育有一定的促進作用。綜上所示,本研究表明LAM可以有效延緩卵母細胞老化,增強老化卵母細胞發(fā)育潛能,提高豬胚胎的體外發(fā)育率;KAE可以維持老化卵母細胞質量,延緩卵母細胞老化,有效緩解H2O2引起的早期胚胎的氧化損傷,對豬胚胎發(fā)育起到促進的作用。
【學位授予單位】：延邊大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2019
【分類號】：S828
【圖文】：

為了確定ＬＡＭ是否能提高老化卵母細胞囊胚率和囊胚質量，對成熟卵逡逑母細胞進行孤雌激活。通過劑量試驗研究，選擇囊胚率最高的ＬＡＭ劑量，逡逑作為最佳ＬＡＭ濃度。最終濃度為２０邋ｐｇ／ｍｌ邋ＬＡＭ，并用于后續(xù)研宄（圖２．１．Ａ）。逡逑孤雌激活后，對照組卵母細胞（體外培養(yǎng)不需額外培養(yǎng)２４小時）囊胚率為逡逑５６．７３±１．２３％。而老化２４小時卵母細胞囊胚率僅為２８．６８±邋１．９７％。但是添逡逑加２０邋ｎｇ／ｍｌ邋ＬＡＭ后老化２４小時的卵母細胞囊胚率為４５．３３±２．０５％，相比老逡逑化未添加ＬＡＭ組囊胚率顯著增加（Ｐ＜邋０．０１）。逡逑探究ＬＡＭ對老化卵母細胞發(fā)育的影響，統計了新鮮和老化卵母細胞發(fā)逡逑育的囊胚內細胞總數（圖２．１．Ｂ和Ｃ）。老化２４小時后的卵母細胞發(fā)育成囊胚逡逑后細胞總數顯著低于新鮮卵母細胞發(fā)育成囊胚后的細胞總數。老化后的卵逡逑母細胞中，ＬＡＭ處理組相比老化組顯著增加了囊胚內總細胞數。為了進一逡逑步確定ＬＡＭ對凋亡相關基因表達的影響，測量了各組囊胚中Ｃａｓｐａｓｅ－３、逡逑Ｂａｘ、Ｂｃｌ－２基因的ｍＲＮＡ表達水平（圖２．１．邋Ｄ）。老化卵母細胞發(fā)育成囊胚后逡逑Ｃａｓｐａｓｅ－３和Ｂａｘ的表達水平顯著高于新鮮卵母細胞組。然而，ＬＡＭ處理組逡逑降低了老化卵母細胞發(fā)育成囊胚后Ｃａｓｐａｓｅ－３和Ｂａｘ基因的表達（Ｆ＜邋０．０１）。逡逑在老化后的卵母細胞中，ＬＡＭ處理組的卵母細胞與未處理組相比，Ｂｃｌ－２逡逑轉錄水平無顯著差異（尸＞邋０．０５）。逡逑１５逡逑

逡逑圖２．４邋ＬＡＭ對老化卵母細胞組織蛋白酶Ｂ活性的影響。（Ａ）具有代表性的圖像顯示逡逑組織蛋白酶Ｂ在卵母細胞中的活性，標尺：１０0Ｐｍ。（Ｂ）相對定量檢測卵母細胞組織逡逑蛋白酶Ｂ的熒光強度顯，Ｒ邋＝邋３。逡逑Ｆｉｇｕｒｅ．２．４．邋Ｔｈｅ邋ｅｆｆｅｃｔ邋ｏｆ邋ＬＡＭ邋ｏｎ邋ｃａｔｈｅｐｓｉｎ邋Ｂ邋ａｃｔｉｖｉｔｙ邋ｏｆ邋ａｇｅｄ邋ｏｏｃｙｔｅｓ．邋（Ａ）逡逑Ｒｅｐｒｅｓｅｎｔａｔｉｖｅ邋ｉｍａｇｅｓ邋ｓｈｏｗｉｎｇ邋ｃａｔｈｅｐｓｉｎ邋Ｂ邋ａｃｔｉｖｉｔｙ邋ｉｎ邋ｆｒｅｓｈ，邋ａｇｅｄ，邋ａｎｄ邋ＬＡＭ－ｔｒｅａｔｅｄ邋Ｍｉｌ逡逑ｏｏｃｙｔｅｓ．邋Ｓｃａｌｅ邋ｂａｒ：邋１００邋｜ｉｍ．邋（Ｂ）邋Ｑｕａｎｔｉｆｉｅｄ邋ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ邋ｉｎｔｅｎｓｉｔｙ邋ｆｏｒ邋ｃａｔｈｅｐｓｉｎ邋Ｂ邋ｉｎ逡逑ｏｏｃｙｔｅｓ．邋Ｒ＝３．逡逑Ａ逡逑Ｆｒｅｓｈ邐Ａｇｅｄ邐Ａｇｅｄ＋ＬＡＭ逡逑煖幽逡逑Ｂ逡逑ｋ邋２．５－，逡逑！邋２．０－邐Ａ逡逑Ｃ逡逑名‘邋１＞邐－１－邐？逡逑ｃ逡逑１．０－逡逑Ｓ邋０．５邋■丨■ｊＵｐ１逡逑三邋0．0邋Ｊ＿＾邐邋－邋．ｊ邐邋一；一．「：．一ｓ逡逑ｒｊｍ邐Ｆｒｅｓｈ邐Ａｇｅｄ邋Ａｇｅｄ＋ＬＡＭ逡逑圖２．５邋ＬＡＭ對老化卵母細胞ｃａｓｐａｓｅ－３活性的影響。（Ａ）表示卵母細胞中ｃａｓｐａｓｅ－３逡逑活性

３．２．１邋ＩＶＣ期間添加ＬＡＭ對豬早期胚胎發(fā)育能力的影響逡逑在ＩＶＣ培養(yǎng)基中添加２０邋ｎｇ／ｍＬ邋ＬＡＭ，檢測ＬＡＭ對孤雌激活胚胎發(fā)育逡逑的影響。如圖３．１所示，ＬＡＭ處理組相比對照組顯著提高了卵裂率（７９．９３逡逑±１．１６％ｖｓ８７．５１±０．７４％，Ｐ＜０．０１）。ＬＡＭ處理組相比對照組顯著提高了逡逑第五天囊胚率２邋（８．８７邋±１．９９％邋ｖｓ邋３５．３１邋±１．８１％，尸＜０．０１），第六天囊胚逡逑率（３６．８８邋±邋２．８７％邋ｖｓ邋４７．９１邋±邋４．５７％，尸邋＜邋０．０１邋）和第七天囊胚率（４３．５３邋±邋１．３３％逡逑ｖｓ邋５６．０４邋±３．９９％，尸＜０．０１）。ＬＡＭ處理組與對照組相比第五天囊胚的孵逡逑化率無顯著差異（２．８５±３．２５％ｖｓ６．８８±２．４９，尸＞０．０５），但是ＬＡＭ處理逡逑組相比對照組顯著提高了第六天囊胚孵化率（８．８３邋±邋２．７２％邋ｖｓ邋２２．５３邋±邋１．８０，逡逑尸邋＜０．０１）和第七天囊胚孵化率（２１．４１邋±４．４１％邋ｖｓ邋３３．６３邋±４．１９％，尸＜邋０．０５）。逡逑結果顯示

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本文編號：2796657