發(fā)布時間：2020-08-18 20:01

【摘要】：豬鏈球菌(Streptococcus suis,S.suis)是一種重要的人獸共患病原菌,不僅會給養(yǎng)殖業(yè)造成巨大的經(jīng)濟(jì)損失,而且嚴(yán)重影響人類的公共安全。根據(jù)莢膜多糖抗原的差異可以分為29個血清型,其中2型(SS2)為危害最嚴(yán)重的血清型。首次報道的人感染豬鏈球菌病的國家為丹麥,后來在歐洲,北美洲,南美洲,大洋洲,亞洲等多個地區(qū)都有人感染SS2的報道。雙組份調(diào)控系統(tǒng)是細(xì)菌感應(yīng)外界變化并作出重要應(yīng)答反應(yīng)的一種系統(tǒng),其對細(xì)菌的生長代謝和致病性發(fā)揮著重大的作用。YycG/YycF雙組份系統(tǒng)最早發(fā)現(xiàn)于枯草芽孢桿菌中,后來由于其在細(xì)胞壁代謝中發(fā)揮著重要的作用被命名為WalK/WalR,在肺炎鏈球菌中被命名為VicK/VicR。有文獻(xiàn)報道VicRK在一些細(xì)菌的鏈長、形態(tài)、生長、代謝、細(xì)胞壁穩(wěn)態(tài)、生物被膜、細(xì)胞毒力等方面發(fā)揮著重要的作用,但是在豬鏈球菌中卻沒有相關(guān)的報道。本文主要對豬鏈球菌2型VicRK雙組份系統(tǒng)進(jìn)行研究,了解其作用機(jī)制。具體內(nèi)容如下:1.豬鏈球菌2型vicK基因缺失突變株和互補(bǔ)菌株的構(gòu)建及生物學(xué)特性在構(gòu)建vicK/vicR缺失突變株的過程中發(fā)現(xiàn)vicR基因缺失致死,只構(gòu)建了vicK基因缺失突變株。在ΔvicK突變株的基礎(chǔ)上利用電轉(zhuǎn)化的方法構(gòu)建了互補(bǔ)菌株CΔvicK。通過革蘭氏染色的方法研究了野生株WT、突變株ΔvicK、互補(bǔ)菌株CΔvicK在鏈長,形態(tài)等方面特點(diǎn),結(jié)果顯示三個菌株的鏈長,形態(tài)無明顯的差異,說明vicK基因?qū)S2的鏈長和形態(tài)沒有影響。通過在TSB加10%血清靜止、搖動、加入0.5 mmol/L二酰胺、加入0.5 mmol/L過氧化氫、加入3 mmol/L百草枯以及不加血清等條件下測定三個菌株的生長曲線,結(jié)果顯示除了不加血清的條件,突變株ΔvicK生長速率明顯低于野生株和互補(bǔ)菌株,其他條件三個菌株生長沒有明顯差異,說明vicK基因除了在低營養(yǎng)條件下對SS2的生長有影響外在其他條件下并不對SS2造成影響。2.vicK基因?qū)S2致病性的影響對hBMEC(人腦微血管內(nèi)皮細(xì)胞)黏附和Hep-2細(xì)胞(人喉癌上皮細(xì)胞)黏附、入侵實驗中,發(fā)現(xiàn)vicK基因缺失突變株ΔvicK的黏附、入侵能力明顯低于野生株和互補(bǔ)菌株。在人血全血?dú)⒕鷮嶒炛?發(fā)現(xiàn)突變株ΔvicK在全血中的存活能力明顯低于野生株,說明vicK基因在SS2抵抗先天性免疫中發(fā)揮著重要的作用。在仔豬競爭感染實驗中,發(fā)現(xiàn)突變株ΔvicK在各個器官中的定植能力明顯低于野生株,說明vicK基因在SS2的毒力方面發(fā)揮著重要的作用。為了尋找VicRK雙組份調(diào)控系統(tǒng)調(diào)控的毒力基因,我們做了RNA-seq實驗,并驗證了其數(shù)據(jù)的準(zhǔn)確性,從RNA-seq數(shù)據(jù)中找到了9個可能受控制的毒力基因,并用EMSA(凝膠電泳實驗)驗證了這些毒力基因是受VicRK雙組份調(diào)控系統(tǒng)調(diào)控的。
【學(xué)位授予單位】：華中農(nóng)業(yè)大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2019
【分類號】：S852.611
【圖文】：

pSET4s載體圖譜

13圖 3-2 pSET2 載體圖譜 圖 3-3 pET30a 載體圖譜Figure 3-2 The Map of pSET2 vector Figure 3-3 The Map of pET30a vector3.1.2 主要試劑PrimeSTAR 高保真 DNA 聚合酶及其 Buffer、各種限制性內(nèi)切酶及其 Buffer、T4 DNA 連接酶及其 Buffer、DNA marker（DL2000、DL5000、DL15000）均購自寶生物工程(大連)有限公司。2×Taq Master Mix 酶購于諾唯贊公司。Protein

13圖 3-2 pSET2 載體圖譜 圖 3-3 pET30a 載體圖譜Figure 3-2 The Map of pSET2 vector Figure 3-3 The Map of pET30a vector3.1.2 主要試劑PrimeSTAR 高保真 DNA 聚合酶及其 Buffer、各種限制性內(nèi)切酶及其 Buffer、T4 DNA 連接酶及其 Buffer、DNA marker（DL2000、DL5000、DL15000）均購自寶生物工程(大連)有限公司。2×Taq Master Mix 酶購于諾唯贊公司。Protein

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4 許仲e

本文編號：2796655