【摘要】：自2010年4月鴨坦布蘇病毒病在中國首次被發(fā)現(xiàn)以來,該病迅速在中國沿海地區(qū)廣泛傳播,給養(yǎng)殖產(chǎn)業(yè)造成了巨大的經(jīng)濟(jì)損失。本研究通過構(gòu)建融合性鴨坦布蘇病毒E基因和鴨白介素2基因的重組腺病毒質(zhì)粒,為鴨坦布蘇病毒病的重組腺病毒疫苗的開發(fā)奠定基礎(chǔ)。(1)重組腺病毒rADV-E-IL-2和rADV-E的構(gòu)建及鑒定。用RT-PCR方法分別將1353bp的鴨坦布蘇病毒E基因和鴨350bp的白介素2基因串聯(lián)構(gòu)成1733bp的融合片段克隆到腺病毒穿梭載體中,構(gòu)建出重組腺病毒穿梭質(zhì)粒pshuttle-E-IL-2,同時構(gòu)建病毒E基因質(zhì)粒pshuttle-E作為對照,分別與骨架載體共轉(zhuǎn)染進(jìn)HEK293細(xì)胞,經(jīng)PCR和免疫印跡鑒定獲得重組腺病毒rADV-E-IL-2和rADV-E。病毒可在HEK293細(xì)胞中連續(xù)傳代20代以上,具有基因組穩(wěn)定性。純化后檢測rADV-E-IL-2滴度達(dá)到4.0×10~(10)PFU/mL,rADV-E滴度達(dá)到6.0×10~(10)PFU/mL。(2)重組腺病毒對雛鴨的免疫保護(hù)試驗(yàn)。將80只1日齡雛鴨隨機(jī)均分為五組(rADV-E-IL-2組、rADV-E組、rADV-N組、WF100組和PBS組),分別用重組腺病毒rADV-E-IL-2、重組腺病毒rADV-E、空載的重組腺病毒rADV-N、商品化鴨坦布蘇弱毒疫苗WF100株和PBS于雛鴨7日齡和21日齡進(jìn)行皮下注射。結(jié)果顯示,rADV-E-IL-2組和rADV-E組可誘導(dǎo)產(chǎn)生抗鴨坦布蘇病毒的特異性IgG,rADV-E-IL-2組抗體水平在首免后35d達(dá)到最高峰1.39,和其余組相比差異性顯著(P0.05)。rADV-E-IL-2組和rADV-E組均具有中和病毒能力,rADV-E-IL-2組和rADV-E組中和抗體效價在首免后35d達(dá)到最高峰,rADV-E-IL-2組為1:55,rADV-E組為1:44。rADV-E-IL-2組和rADV-E組均能顯著提高外周淋巴細(xì)胞的增殖,增殖指數(shù)分別為3.13和2.69,與rADV-N組、PBS組相比差異性顯著(P0.05)。rADV-E-IL-2組和rADV-E組血清中細(xì)胞因子IL-2含量(94.78pg/mL、76.18pg/mL)、IL-6含量(66.43pg/mL、59.45 pg/mL)和IFN-γ含量(201.51pg/mL、128.61pg/mL)與rADV-N組、PBS組相比差異性顯著(P0.05)。在攻毒保護(hù)試驗(yàn)中,rADV-E-IL-2組和rADV-E組雛鴨未發(fā)生臨床癥狀,剖檢脾臟無病變。rADV-E-IL-2組檢測脾臟內(nèi)鴨坦布蘇病毒拷貝數(shù)為101.22copies/μL,rADV-E為101.81copies/μL,兩者與rADV-N組、PBS組相比差異性顯著(P0.05)。
【學(xué)位授予單位】：四川農(nóng)業(yè)大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2018
【分類號】：S852.65
【圖文】：

結(jié)果.1 目的基因 PCR 擴(kuò)增以DTMUV CQW1株和鴨外周血淋巴細(xì)胞cDNA為模板，用待融合DTMUV E物和待融合鴨IL-2基因引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，再將兩個片段進(jìn)行融合擴(kuò)增出E-I片段，凝膠電泳檢測可見一條約1700bp條帶（圖2-1a），與預(yù)期E-IL-2片段大，測序結(jié)果正確；以DTMUV CQW1株cDNA為模板，用CQW1 E基因引物進(jìn)行增，凝膠電泳檢測可見一條約1300bp條帶（圖2-1b），與預(yù)期DTMUV E基因符，測序結(jié)果正確。

圖 2-2 重組穿梭質(zhì)粒 pshuttle- E-IL-2 和 pshuttle- E 的雙酶切鑒定（a）M：DNA Marker；1：pshuttle -E-IL-2 EcoRⅠ/BamHⅠ雙酶切；（b）M：DNA Markpshuttle -E EcoRⅠ/BamHⅠ雙酶切Fig. 2-2 Identification of pshuttle-E-IL-2 and pshuttle-E by restriction endonuclease diges(a)M: DNAMarker; 1: pshuttle-E-IL-2 was digested with EcoRⅠand BamHⅠ(b)M: DNA Marpshuttle-E was digested withEcoRⅠand BamHⅠ3.3 重組腺病毒的包裝將重組穿梭質(zhì)粒和腺病毒骨架載體共轉(zhuǎn)染進(jìn) HEK293 細(xì)胞。如圖 2-3 所示：后第 2d，熒光顯微鏡下部分 HEK293 細(xì)胞可見到有 GFP 的表達(dá)，且轉(zhuǎn)染質(zhì)粒HEK293 細(xì)胞熒光表達(dá)量逐天遞增，先是呈現(xiàn)星云狀然后熒光逐漸向外增加。轉(zhuǎn)第 10d，光學(xué)顯微鏡下可見 HEK293 細(xì)胞形態(tài)發(fā)生變化，如圓縮、聚集成葡萄串明顯病變效應(yīng)，至轉(zhuǎn)染后第 16d，細(xì)胞出現(xiàn)大面積固縮、脫落、裂解等明顯的病收集 HEK293 細(xì)胞反復(fù)凍融 3 次后保存于-80℃。同時，空白對照組細(xì)胞無病變

16圖2-4 重組腺病毒rADV-E-IL-2和rADV-E的PCR鑒定（a）M：DNA Marker；1：rADV-E-IL-2中E-IL-2片段的PCR產(chǎn)物；2：空載腺病毒對照（b）M：DNA Marker；1：rADV-E中DTMUV E基因的PCR產(chǎn)物；2：空載腺病毒對照Fig. 2-4 PCR identification of rADV-E-IL-2 and rADV-E（a）M: DNA Marker ; 1: E-IL-2 fragment amplified from rADV-E-IL-2; 2: rADV-N control.（b）M: DNA Marker ; 1:DTMUV E gene amplified from rADV-E; 2: rADV-N control.3.4.2 重組腺病毒 Western blot 鑒定分別提取重組腺病毒rADV-E-IL-2、rADV-E和空載腺病毒rADV-N感染HEK293細(xì)胞的總蛋白，如圖2-5：經(jīng)western blot檢測，重組腺病毒rADV-E-IL-2能在HEK293細(xì)胞中表達(dá)E-IL-2蛋白，觀察到約70kD大小特異性條帶，與預(yù)測蛋白大小相符；重組腺病毒rADV-E能在HEK293細(xì)胞中表達(dá)DTMUV E蛋白，觀察到約60kD大小特異性條帶，與預(yù)測蛋白大小相符；而感染空載腺病毒rADV-N的細(xì)胞則未能檢測到蛋白條帶。圖2-5 重組腺病毒rADV-E-IL-2和rADV-E的western blot鑒定（a）M：蛋白分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)；1：感染rADV-E-IL-2的細(xì)胞裂解物；2：感染空載腺病毒rADV-N的細(xì)胞裂解物（b）M：蛋白分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)；1：感染重組腺病毒rADV-E的細(xì)胞裂解物Fig

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