本文關(guān)鍵詞：Apa2H1單聚體和三聚體抗原體外活化BMDCs和對小鼠免疫保護(hù)作用的比較，，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

【摘要】：豬胸膜肺炎放線桿菌(Actinobacillus pleuropneumoniae,APP)是引起豬高度傳染性、致死性胸膜肺炎的病原菌,現(xiàn)該病已經(jīng)成為育肥豬和種豬死亡的主要原因之一。該病原菌分為15個(gè)血清型,我國流行的血清型主要為1、3、5和7型,由于疫苗免疫時(shí)各血清型間無交叉保護(hù)作用,給該病的防治帶來很大困難。三聚體自轉(zhuǎn)運(yùn)粘附素(Trimeric Autotransporter Adhesins,TAAs)是新發(fā)現(xiàn)存在于多種致病性革蘭氏陰性菌表面的毒力因子,主要介導(dǎo)細(xì)菌的粘附、定植和免疫逃避,頭部Yad A結(jié)構(gòu)域?yàn)槠渲饕δ軈^(qū)。盡管已有研究表明TAAs具有良好的免疫原性,但發(fā)揮免疫保護(hù)作用的具體結(jié)構(gòu)域尚無統(tǒng)一定論;同時(shí)TAAs自然狀態(tài)成三聚體結(jié)構(gòu),但此三聚體結(jié)構(gòu)在免疫原性和免疫保護(hù)作用方面與單聚體抗原是否存在差異目前仍不明確。本研究以前期發(fā)現(xiàn)的APP血清5b型L20菌株表面TAA結(jié)構(gòu)Apa2為代表,通過預(yù)測Apa2的功能區(qū)為Apa2H1,并以Apa2H1為研究對象,研究三聚體抗原與單聚體抗原在免疫原性方面的差異,為新型亞單位疫苗的制備提供新的理論依據(jù)。通過將Apa2頭部功能區(qū)Apa2H1分別克隆至含有Hia蛋白C-末端跨膜區(qū)修飾的p NS載體和p ET-28a載體,利用原核表達(dá)系統(tǒng)表達(dá)分別獲得類似天然狀態(tài)的三聚體Apa2H1蛋白和單聚體Apa2H1蛋白。將獲得的單聚體、三聚體Apa2H1蛋白與APP宿主細(xì)胞豬肺上皮細(xì)胞系(SJPL)和豬肺巨噬細(xì)胞系(CRL)相互作用檢測Apa2H1蛋白粘附細(xì)胞的能力;將表達(dá)單聚體、三聚體Apa2H1蛋白的大腸桿菌分別與正�；騿尉垠w、三聚體Apa2H1蛋白預(yù)處理的SJPL和CRL相互作用,檢測Apa2H1在細(xì)菌粘附和侵襲細(xì)胞中的作用;最后將APP與正�；騿尉垠w、三聚體Apa2H1蛋白預(yù)處理的SJPL和CRL相互作用,驗(yàn)證Apa2H1蛋白在APP粘附和侵襲宿主細(xì)胞中的作用。結(jié)果顯示兩種形式的Apa2H1蛋白均可以直接粘附細(xì)胞,并顯著促進(jìn)細(xì)菌粘附和侵襲細(xì)胞,而宿主細(xì)胞與Apa2H1蛋白預(yù)作用可以降低Apa2H1蛋白的這種促進(jìn)作用。證實(shí)Apa2H1蛋白是Apa2的功能結(jié)構(gòu)域,參與細(xì)菌的粘附和侵襲。為探討Apa2H1蛋白是否具有免疫原性,能否用于開發(fā)APP亞單位疫苗,首先將三聚體Apa2H1蛋白在體外與小鼠骨髓來源的樹突狀細(xì)胞(bone marrow dendritic cells,BMDCs)相互作用,檢測其活化BMDCs的能力;再將三聚體Apa2H1蛋白與弗氏佐劑混合后免疫小鼠,體內(nèi)檢測Apa2H1蛋白的免疫原性和免疫保護(hù)作用。結(jié)果顯示Apa2H1蛋白在體外具有刺激活化BMDCs的能力,并能誘導(dǎo)多種T、B淋巴細(xì)胞增殖、分化、活化誘導(dǎo)因子的釋放;Apa2H1蛋白免疫可以誘導(dǎo)高強(qiáng)度的體液免疫和適度的Th1/Th2混合T細(xì)胞應(yīng)答,且產(chǎn)生的特異性免疫應(yīng)答在APP感染早期和晚期分別可以顯著(p0.05)和極顯著(p0.01)的降低APP在小鼠肺臟和血液的定植,降低肺臟炎癥反應(yīng)程度,提高小鼠的存活率(40%,p0.01)。證實(shí)Apa2H1蛋白具有良好的免疫原性,并具有免疫保護(hù)作用,是APP潛在的疫苗候選蛋白。為進(jìn)一步探討三聚體抗原和單聚體抗原的抗原學(xué)差異,本研究以Apa2H1抗原為代表,首先將Apa2H1三聚體、單聚體蛋白在體外與BMDCs作用,觀察活化BMDCs能力的差異;再分別添加佐劑和不添加佐劑免疫小鼠,在體內(nèi)檢測兩種抗原在小鼠體內(nèi)的免疫學(xué)差異。結(jié)果顯示三聚體抗原刺激活化BMDCs的能力顯著強(qiáng)于(p0.05)單聚體抗原;在有佐劑免疫時(shí)三聚體、單聚體誘導(dǎo)小鼠產(chǎn)生的特異性抗體水平和免疫保護(hù)作用無顯著差異(p0.05),但是在無佐劑免疫時(shí),三聚體在初次免疫和加強(qiáng)免疫后均可以誘導(dǎo)更高水平的特異性抗體,與單聚體抗原免疫相比較,能顯減低肺臟炎性細(xì)胞浸潤和顯著延遲感染致死劑量APP小鼠的死亡時(shí)間(p0.05)。從體外、體內(nèi)實(shí)驗(yàn)證實(shí)三聚體抗原的抗原性優(yōu)于單聚體抗原。本研究證實(shí)Apa2H1頭部結(jié)構(gòu)域是Apa2的主要功能區(qū),并初步闡明其可以促進(jìn)APP對宿主細(xì)胞的粘附、侵襲;同時(shí)證實(shí)了此頭部功能區(qū)具有良好的免疫原性,是APP潛在的疫苗候選蛋白;提供了制備三聚體蛋白的新方法,證明了三聚體抗原較單聚體抗原具有更好的免疫原性。此成果不但可直接用于豬傳染性胸膜肺炎疫苗研究,有助于豬胸膜肺炎放線桿菌的防治,減少國內(nèi)外養(yǎng)豬業(yè)的經(jīng)濟(jì)損失;更為新型三聚化蛋白疫苗的研究提供理論和實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。
【關(guān)鍵詞】：胸膜肺炎放線桿菌 三聚體自轉(zhuǎn)運(yùn)粘附素 三聚體抗原 單聚體抗原 BMDCs 免疫原性
【學(xué)位授予單位】：吉林大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號】：S852.4
【目錄】：

• 中文摘要5-7
• Abstract7-12
• 中英文縮略詞12-13
• 前言13-15
• 第一篇 文獻(xiàn)綜述15-28
• 1. 三聚體自轉(zhuǎn)運(yùn)粘附素的共同分子結(jié)構(gòu)16-19
• 2. TAAs的跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)19-21
• 3. TAAs功能及其機(jī)制的新發(fā)現(xiàn)21-25
• 4. TAAs的潛在應(yīng)用25-27
• 5. 未來TAAs的研究方向的評述27-28
• 第二篇 研究內(nèi)容28-89
• 第1章 Apa2H1單聚體、三聚體抗原的制備和功能研究28-51
• 1.1 材料與方法29-39
• 1.2 結(jié)果39-47
• 1.3 討論47-50
• 1.4 小結(jié)50-51
• 第2章 Apa2H1單聚體、三聚體對BMDCs的活化作用51-67
• 2.1 材料與方法52-56
• 2.2 結(jié)果56-65
• 2.3 討論65-66
• 2.4 小結(jié)66-67
• 第3章 Apa2H1三聚體蛋白的體內(nèi)免疫原性及對小鼠的免疫保護(hù)作用67-81
• 3.1 材料與方法67-70
• 3.2 結(jié)果70-78
• 3.3 討論78-80
• 3.4 小結(jié)80-81
• 第4章 Apa2H1單聚體、三聚體蛋白體內(nèi)免疫原性和免疫保護(hù)作用差異比較81-89
• 4.1 材料與方法81-82
• 4.2 結(jié)果82-87
• 4.3 討論87-88
• 4.4 小結(jié)88-89
• 結(jié)論89-90
• 參考文獻(xiàn)90-99
• 導(dǎo)師簡介99-100
• 作者簡介100-101
• 攻讀碩士期間發(fā)表的學(xué)術(shù)論文及其他成果101-102
• 致謝102

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