【摘要】：精子結(jié)構(gòu)、生化和生理功能在冷凍解凍過程中會(huì)受到嚴(yán)重的破壞,如何將精液在冷凍解凍過程所受的損傷降到最低一直是人們研究的熱點(diǎn)。為了進(jìn)一步提高絨山羊精液冷凍保存后的質(zhì)量,本研究以Tris稀釋液為基礎(chǔ),比較了液氮熏蒸高度、精清、卵黃和大豆卵磷脂對(duì)內(nèi)蒙古絨山羊精液的冷凍保存效果的影響,篩選出適合絨山羊精液冷凍保存的方法;在此基礎(chǔ)上研究了氧化磷酸化和糖酵解對(duì)絨山羊精液冷凍保存和解凍后的作用;并進(jìn)一步分析了葡萄糖、海藻糖和膽固醇在絨山羊精液冷凍保存過程中作用機(jī)制。精液冷凍解凍后分別檢測(cè)了精子運(yùn)動(dòng)性能、精子結(jié)構(gòu)完整性、精子中活性氧(ROS)、Ca2+、ATP;精子懸浮液中的丙酮酸和乳酸水平;檢測(cè)了精子凋亡率和線粒體膜電位;分析了精子中AMPK、phospho-AMPK以及蛋白質(zhì)酪氨酸磷酸化。結(jié)果如下:1、精液經(jīng)稀釋后冷卻至5℃,在距離液氮液面H1(4cm)和H2(9cm)處熏蒸7min后冷凍保存,結(jié)果表明,冷凍解凍后,與H1(4cm)相比,H2(9cm)組的精子活率極顯著降低(P0.01),頂體完整性和質(zhì)膜完整性極顯著降低(P0.01),DNA完整性無顯著差異。因此,在距離液氮液面4cm處熏蒸7min后冷凍保存效果較好。在精液冷凍保存過程中,去除精清,結(jié)果顯示冷凍解凍后精子活率和速率極顯著降低(P0.01),精子頂體完整性和質(zhì)膜完整性顯著降低(P0.05),DNA完整性極顯著降低(P0.01),以及脂質(zhì)過氧化水平極顯著升高(P0.01),因此,精清的存在更有利于精子的冷凍保存。在絨山羊精液冷凍保存過程中,在冷凍稀釋液中添加1.5%大豆卵磷脂與10%卵黃相比,精子運(yùn)動(dòng)性能、結(jié)構(gòu)完整性和脂質(zhì)過氧化水平無顯著性差異,因此大豆卵磷脂可以代替卵黃保護(hù)精子免受冷凍損傷。2、在絨山羊精液冷凍保存過程中,抑制氧化磷酸化和糖酵解作用后,冷凍解凍后,精子運(yùn)動(dòng)性能和結(jié)構(gòu)完整性顯著下降(P0.05),線粒體膜電位顯著降低(P0.05),脂質(zhì)過氧化水平極顯著升高(P0.01)。解凍后,抑制氧化磷酸化作用后,精子幾乎失去運(yùn)動(dòng)能力,線粒體膜電位顯著下降(P0.05);抑制糖酵解作用后,精子運(yùn)動(dòng)性能顯著下降(P0.05),然而線粒體膜電位無顯著性差異。因此,在絨山羊精液冷凍保存過程中,糖酵解和氧化磷酸化對(duì)維持精子的質(zhì)量和代謝具有同等重要的作用。解凍后氧化磷酸化和糖酵解對(duì)維持精子的運(yùn)動(dòng)性能均具有重要的作用;在維持線粒體活性方面,氧化磷酸化的作用更明顯。3、在冷凍稀釋液中添加不同濃度(0-112mmol)的葡萄糖,結(jié)果發(fā)現(xiàn)56 mmol葡萄糖可以明顯提高精子冷凍解凍后活率、運(yùn)動(dòng)速率、頂體和質(zhì)膜完整性(P0.05)。56 mmol葡萄糖組中的精子細(xì)胞中ROS水平顯著升高(P0.01);28 mmol和56 mmol葡萄糖組中的精子細(xì)胞中Ca2+水平顯著低于其它各組(P0.01);與其它各組相比,56 mmol和84 mmol葡萄糖組中的精子細(xì)胞中ATP濃度較高(P0.05)。精液解凍后,在低葡萄糖濃度組(28-56 mmol)的精子懸浮液中未檢測(cè)到乳酸,而112 mmol組中檢測(cè)到大量乳酸(P0.01)。因此,冷凍稀釋液中添加適量葡萄糖可以促進(jìn)精子的代謝,但高濃度葡萄糖可能因?yàn)槿樗岬拇罅慨a(chǎn)生抑制精子冷凍保存后的運(yùn)動(dòng)能力。4、精液稀釋于含有海藻糖和和葡萄糖的稀釋液中,對(duì)精子的活率、質(zhì)膜完整性和頂體完整性無顯著性影響,但DNA完整性和線粒體膜電位顯著升高(P0.05),精子中ROS和Ca2+水平顯著降低(P0.01),以及顯著降低脂質(zhì)過氧化水平(P0.05);在GT-100組(100mmol海藻糖和56mmol葡萄糖),解凍后,在頂體前端、赤道段和精子尾部中段發(fā)現(xiàn)存在大量的phospho-AMPK。因此,海藻糖可能通過激活A(yù)MPK發(fā)揮抗氧化作用。5、精液經(jīng)過不同濃度膽固醇環(huán)糊精(CLC)處理后,沒有引起精子活率的差異(P0.05),但頂體和質(zhì)膜完整性顯著升高(P0.05),DNA完整性極顯著升高(P0.01);精液經(jīng)過1 mg/ml和2 mg/ml的CLC處理后,解凍后的精子線粒體膜電位顯著升高(P0.05),精子中ROS水平顯著下降,Ca2+水平顯著下降(P0.05);2 mg/ml的CLC處理降低了冷凍解凍后精子中70 KDa蛋白酪氨酸磷酸化,并延遲了A23187對(duì)精子誘導(dǎo)的頂體反應(yīng)�？傊�,將絨山羊精液稀釋于含有56 mmol葡萄糖的Tris稀釋液中,冷卻至5℃的精液在距離液氮液面4 cm處熏蒸7 min后冷凍,最適合內(nèi)蒙古絨山羊精液冷凍保存。葡萄糖、海藻糖和膽固醇通過不同的作用途徑影響了絨山羊精液的冷凍保存。通過以上研究,為絨山羊精液冷凍保存提供理論依據(jù)。
【學(xué)位授予單位】：內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2018
【分類號(hào)】：S827
【圖文】：

的冷凍速率都可能導(dǎo)致細(xì)胞受到冷凍損傷，合適的形成冰晶而損傷細(xì)胞，另外，不同類型的細(xì)胞都存速率。保存過程中，除了冷凍過程會(huì)對(duì)精子造成機(jī)械損傷，對(duì)精子造成損傷。在解凍過程中通過水浴溫度和。在山羊精液冷凍保存的早期研究中，將凍精細(xì)管解凍 12-30s，或者，將凍精細(xì)管置于 5℃的水浴中 的方法優(yōu)于緩慢解凍方法[53]。事實(shí)上，低解凍速率而且由于進(jìn)入細(xì)胞的滲透性保護(hù)劑不會(huì)快速地離開，使水滲入細(xì)胞，最終破壞質(zhì)膜結(jié)構(gòu)。因此，最佳解凍過程中細(xì)胞內(nèi)外滲透壓的平衡。也有研究發(fā)現(xiàn)度提高到 70℃，7s，與 37℃ 2 min 或 40℃ 20s 相質(zhì)膜完整性顯著提高[54]，然而要嚴(yán)格控制時(shí)間，因度特別敏感。

圖 2 流式細(xì) 胞儀檢測(cè)解 凍后精子質(zhì)膜完Fig.2 Flow cytometry detect the post-thaw sperm acrosomembrane and DNA integr注： （ A） 精 子 細(xì) 胞 群 ， （ B） 精子 自 發(fā) 光 密度 圖 ， C.PI/A質(zhì)膜損傷精子 細(xì)胞；Q2-2：質(zhì)膜 損壞的晚 凋亡精子細(xì)胞； Q質(zhì) 膜完 整 的 早 凋 亡 精 子 細(xì) 胞。 D.Acridine Orange 熒 光染 色 整的精子細(xì)胞 群，靠近橫軸是 DNA 斷鏈或解旋的精子細(xì)胞熒光為 DNA 完整，橘色熒光是 DNA 斷鏈或解旋。Note ： A. Sperm population; B. Sperm auto- fluorescent fluorescent density map. Q2-1. sperm with a damaged plasma with a damaged plasma membrane; Q2-3. live sperm with a apoptotic sperm with a intact plasma membrane. D. Acridine panel shows sperm with a intact DNA close to the vertical axhorizontal axis. The left panel is observed under a fluorescenintact DNA, orange fluorescence is DNA damaged.

內(nèi)蒙古絨山羊精液冷凍保存方法優(yōu)化及精液稀釋液主要成份的作用機(jī)制研究子（如圖 3A）馬斯亮藍(lán)染色法：將一支凍精細(xì)管解凍后，加入適量 PBS 洗滌心 3 min，小心除去上清。加入 1 mL 3.7%的多聚甲醛，懸 20 mi n，離心去上清（同上）。PBS 洗滌兩次后懸浮，取適涂片，空氣干燥。之后利用 0.22%的考馬斯亮藍(lán)染液染色 5 mO 洗去多余染液，空氣干燥后，中性樹膠封片，進(jìn)行顯微鏡計(jì)五個(gè)不同的視野，200 個(gè)精子以上。考馬斯亮藍(lán)染色后，不同的類型，Ⅰ型：頂體完整，外形正常，著色均勻，頂體型：頂體輕微膨脹，質(zhì)膜疏松膨大；Ⅲ型：頂體破壞（或者精子質(zhì)膜嚴(yán)重膨脹受損，著色淺，邊緣不整齊；Ⅳ型：頂體壞。統(tǒng)計(jì)Ⅰ和Ⅱ?yàn)橥暾旙w精子。

【參考文獻(xiàn)】

相關(guān)期刊論文 前3條

1 薛健;于軒;楊軍祥;謝文章;王珂;;離心去除精漿對(duì)絨山羊細(xì)管凍精品質(zhì)的影響[J];畜牧獸醫(yī)雜志;2015年05期

2 徐振軍;趙冰;魏丹;劉冰;車世德;卓鵬;;絨山羊精液冷凍保存技術(shù)的研究[J];中國(guó)畜牧雜志;2009年01期

3 祝發(fā)明;杜保華;曹斌云;;波爾山羊冷凍精液稀釋液配方研究[J];中國(guó)畜牧雜志;2005年12期

本文編號(hào)：2795515