【摘要】：冠狀病毒(Coronavirus,CoV)屬于套式病毒目(Nidovirales)冠狀病毒科(Coronaviridae),其感染宿主范圍十分廣泛,包括鳥類、人以及其他哺乳動(dòng)物。根據(jù)國(guó)際病毒分類委員會(huì)第九次報(bào)告,冠狀病毒可分為α、β、γ、δ4個(gè)屬。在冠狀病毒編碼的蛋白中,除了傳統(tǒng)的結(jié)構(gòu)蛋白和非結(jié)構(gòu)蛋白,還存在數(shù)量不等、零散分布在結(jié)構(gòu)蛋白之間或內(nèi)部的輔助蛋白(accessory protein)。這些輔助蛋白具有種屬特異性,與其他已知蛋白沒有同源性或者同源性非常低。根據(jù)目前關(guān)于SARS-CoV等冠狀病毒輔助蛋白的研究結(jié)果,證實(shí)冠狀病毒輔助蛋白是病毒復(fù)制非必需的,但參與了免疫調(diào)控,并且與病毒的毒力相關(guān)。2014年美國(guó)首次報(bào)道豬場(chǎng)爆發(fā)豬δ冠狀病毒(PDCoV),引起新生仔豬的腹瀉、嘔吐、死亡。隨后,多個(gè)國(guó)家報(bào)道了該病的發(fā)生與流行,引起養(yǎng)豬業(yè)的高度關(guān)注。根據(jù)基因組序列預(yù)測(cè)PDCoV可編碼兩個(gè)輔助蛋白NS6和NS7,但沒有得到實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證,其功能也有待分析。另外,除了NS6和NS7外,PDCoV是否還編碼其它的輔助蛋白也不清楚。因此,本研究以PDCoV CHN-HN-2014毒株為代表,對(duì)其假定編碼的輔助蛋白進(jìn)行鑒定,同時(shí)探究它們與宿主天然免疫反應(yīng)之間的關(guān)系。具體研究?jī)?nèi)容如下:1.PDCoV輔助蛋白NS6的鑒定參照PDCoV CHN-HN-2014全基因組序列,設(shè)計(jì)兩條特異性引物(Leader-F,NS6r),分別位于基因組5'端前導(dǎo)序列以及NS6基因3'末端。提取病毒感染的細(xì)胞總RNA,進(jìn)行RT-PCR和測(cè)序分析,結(jié)果顯示NS6是一個(gè)獨(dú)立的亞基因組(subgenomic RNA,sgmRNA),采用了非經(jīng)典的調(diào)控序列(transcription regulating sequences,TRS),且位于預(yù)測(cè)的TRS上游。隨后,通過(guò)單克隆抗體的制備成功獲得兩株穩(wěn)定分泌NS6特異性抗體的雜交瘤細(xì)胞。間接免疫熒光(IFA)和Western blot分析表明:兩株單抗(2G3和4B9)可特異性識(shí)別過(guò)表達(dá)的NS6蛋白或PDCoV感染的LLC-PK1細(xì)胞,證實(shí)NS6蛋白在病毒感染早期表達(dá),而且定位于細(xì)胞質(zhì)中。進(jìn)一步分析發(fā)現(xiàn),NS6蛋白主要定位于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)高爾基體室,部分定位于高爾基體。這些結(jié)果首次證實(shí)了NS6蛋白在PDCoV感染細(xì)胞中的表達(dá),而且NS6是一個(gè)獨(dú)立的亞基因組,采用了非經(jīng)典的TRS(ACACCT)。2.PDCoV輔助蛋白NS7的鑒定及NS7a的發(fā)現(xiàn)根據(jù)預(yù)測(cè)的PDCoV NS7的序列,設(shè)計(jì)引物將預(yù)測(cè)的NS7基因克隆至pGEX-KG原核表達(dá)載體中,獲得重組質(zhì)粒pGEX-KG-NS7。隨后,經(jīng)IPTG誘導(dǎo)表達(dá)獲得GST-NS7融合蛋白,進(jìn)一步通過(guò)單克隆抗體制備成功獲得4株穩(wěn)定分泌NS7蛋白特異性抗體的雜交瘤細(xì)胞。IFA證實(shí)4株單克隆抗體都能特異性識(shí)別PDCoV感染的或過(guò)表達(dá)NS7的LLC-PK1細(xì)胞。Western blot分析發(fā)現(xiàn),4株單克隆抗體與PDCoV感染的細(xì)胞反應(yīng)時(shí),除了能檢測(cè)到NS7蛋白條帶外,還出現(xiàn)了一條大小約12 kDa的特異性蛋白條帶。但是,這個(gè)小蛋白條帶在過(guò)表達(dá)NS7的細(xì)胞中并沒有出現(xiàn)。隨后,通過(guò)分析PDCoV感染細(xì)胞后病毒的亞基因組RNA,發(fā)現(xiàn)存在一條采用非經(jīng)典TRS的新的亞基因組RNA,其ORF的3'末端與NS7 3'末端完全相同,可編碼大小為100個(gè)氨基酸的多肽,說(shuō)明可能存在一個(gè)新的輔助蛋白,將其命名為NS7a。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn),過(guò)表達(dá)的NS7a蛋白能被4株針對(duì)NS7的單克隆抗體特異性識(shí)別,并且與病毒感染條件下檢測(cè)到的較小的蛋白大小一致。這些結(jié)果表明PDCoV確實(shí)編碼了一個(gè)新的輔助蛋白NS7a,是一個(gè)獨(dú)立的亞基因組,而且采用了非經(jīng)典的TRS(ACCCCA)。3.PDCoV輔助蛋白NS6拮抗IFN-β產(chǎn)生的機(jī)制先前的研究已經(jīng)證實(shí)PDCoV編碼了3個(gè)輔助蛋白(NS6、NS7、NS7a),但是這些輔助蛋白是否也具有免疫調(diào)節(jié)功能尚不清楚。因此,我們以NS6為代表對(duì)PDCoV輔助蛋白調(diào)控天然免疫的特性進(jìn)行了進(jìn)一步研究。將NS6克隆至pCAGGS-HA載體中獲得真核表達(dá)質(zhì)粒pCAGGS-HA-NS6,轉(zhuǎn)染細(xì)胞進(jìn)行超表達(dá),發(fā)現(xiàn)NS6蛋白能顯著抑制仙臺(tái)病毒(Sendai virus,SeV)誘導(dǎo)的IFN-β啟動(dòng)子活性以及IFN-β蛋白表達(dá),而且抑制SeV誘導(dǎo)的關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子IRF3和NF-κB的磷酸化以及入核,表明NS6蛋白能夠拮抗IFN-β產(chǎn)生。但令人驚奇的是,NS6蛋白對(duì)RLRs(RIG-I-like receptors)信號(hào)通路關(guān)鍵分子(RIG-I/RIG-IN、MDA5、MAVS、TBK1、IKKε、IRF3)介導(dǎo)的IFN-β啟動(dòng)子活性并沒有抑制作用,提示NS6蛋白可能靶向RIG-I/MDA5或其上游。同時(shí),通過(guò)免疫共沉淀實(shí)驗(yàn)(Co-IP)和IFA分析發(fā)現(xiàn),NS6與RIG-I/MDA5存在相互作用,而且這種相互作用并不依賴于RNA;進(jìn)一步分析表明,NS6蛋白與RIG-I的CTD區(qū)域以及MDA5的Hel和CTD區(qū)域發(fā)生相互作用,RNA pull-down分析證實(shí)NS6不是一個(gè)RNA結(jié)合蛋白。隨后的Co-IP競(jìng)爭(zhēng)性試驗(yàn)結(jié)果也證實(shí)NS6蛋白能顯著減弱RIG-I/MDA5與dsRNA的結(jié)合。上述結(jié)果表明NS6采用了一種新的免疫抑制策略,抑制RLRs介導(dǎo)的IFN-β產(chǎn)生。
【學(xué)位授予單位】：華中農(nóng)業(yè)大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2018
【分類號(hào)】：S852.651
【圖文】：

豬 冠狀病毒輔助蛋白的鑒定及 NS6 抑制 IFN-β 產(chǎn)生的機(jī)制研究RdRp），對(duì)病毒負(fù)鏈 RNA 合成必不可少，另外有研究發(fā)現(xiàn) nsp8 也能起始 RNA 的合成，其 C 端與病毒 RdRp 的催化活性區(qū)有一定程度的同源，可能作為引發(fā)酶合成引物供 RdRp 使用（Imbert et al 2006）。Nsp13 是超家族 1 解旋酶（Helicase, Hel），Nsp14 含有核酸外切酶活性（ Exonuclease, ExoN ）和 N7- 甲基轉(zhuǎn)移酶活性（N7-Methyltransferase），Nsp15 具有核酸內(nèi)切酶活性（Endonuclease, EndoU），而nsp16 含有 2'-O-甲基轉(zhuǎn)移酶活性（2'-O-methyltransferase）。這些成熟的非結(jié)構(gòu)蛋白參與病毒基因組的復(fù)制以及亞基因組（sgmRNA）的合成。另外，基因組 3'端編碼病毒結(jié)構(gòu)蛋白（S, E, M, N）以及零散分布在結(jié)構(gòu)蛋白之間或內(nèi)部的輔助蛋白。以TGEV 為代表的冠狀病毒基因結(jié)構(gòu)見圖 1-2。

反向遺傳學(xué)技術(shù)研究證實(shí)前導(dǎo)序列的 TRS-L 與未成熟負(fù)鏈的 cTRS-B 堿基互補(bǔ)配對(duì)在動(dòng)脈炎病毒和冠狀病毒轉(zhuǎn)錄過(guò)程中是必不可少的步驟（Pasternak et al 2001,Zuniga et al 2004）。根據(jù)目前冠狀病毒及動(dòng)脈炎病毒轉(zhuǎn)錄過(guò)程的研究，有文獻(xiàn)提出一種負(fù)鏈 RNA 不連續(xù)轉(zhuǎn)錄模式（圖 1-4），主要包括三個(gè)步驟：1. 形成基因組 RNA

盡管 RIG-I 與 MDA5 具有類似的結(jié)構(gòu)，但是它們識(shí)別的病毒具有差異性。識(shí)別仙臺(tái)病毒（Sendai virus, SEV）、新城疫病毒（Newcastle disease virus, NDV副黏病毒科成員(Fournier et al 2012, Martinez-Gil et al 2013, Jorgensen et al 2018病毒科成員，如日本乙型腦炎病毒（Japanese encephalitis virus, JEV）、丙型肝毒（Hepatitis C virus, HCV）以及彈狀病毒科成員，如水泡性口炎病毒（Vesstomatitis virus, VSV）、狂犬病毒（Rabies virus，RV）和埃博拉病毒（Ebola virus, E（Saito et al 2008, Nazmi et al 2011, Schirrmacher 2015）。另外，RIG-I 還能識(shí)別DNA 病毒，包括腺病毒、牛痘病毒以及單純皰疹性病毒（Herpes simplex virus, H（Crill et al 2015）。而 MDA5 識(shí)別小 RNA 病毒科成員，如脊髓灰質(zhì)炎病毒、肌炎病毒（Encephalomyocarditis virus, EMCV）、柯薩奇病毒（Gitlin et al 2006還有一些病毒同時(shí)能被 RIG-I/MDA5 識(shí)別，如登革熱病毒（Dengue virus, DEN西尼羅病毒（West Nile virus, WNV）、鼠肝炎病毒（Mouse hepatitis virus, MH圖 1-7 RLRs 功能域組成示意圖（Wu et al 2014）Fig.1-7 The functional domain organization of RLRs

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本文編號(hào)：2794670