【摘要】：養(yǎng)羊業(yè)是我國畜牧產(chǎn)業(yè)經(jīng)濟(jì)發(fā)展的重要組成部分,其繁殖力、羔羊出生率等直接關(guān)系到牧民的經(jīng)濟(jì)收入。為了畜牧業(yè)的發(fā)展,越來越多的核移植、胚胎移植等技術(shù)早已應(yīng)用到生產(chǎn)實(shí)踐上來,但這些技術(shù)的發(fā)展又存在胚胎著床率低下的問題,是一個(gè)復(fù)雜的生理過程,也是妊娠建立的一個(gè)關(guān)鍵環(huán)節(jié)。TLR4是近幾年研究次數(shù)最頻繁、領(lǐng)域最廣泛的基因,與LPS配體結(jié)合能夠激活TLR4信號(hào)傳導(dǎo)通路,引起下游各種炎癥因子與激素的釋放,并能夠相互作用調(diào)控細(xì)胞的許多功能,可能涉及哺乳動(dòng)物胚胎附植,所以有關(guān)胚胎附植基因表達(dá)的研究也成為了熱點(diǎn)。目的:本實(shí)驗(yàn)通過研究TLR4在綿羊胚胎附植期子宮內(nèi)膜上的表達(dá)模式,從細(xì)胞水平上驗(yàn)證TLR4對(duì)附植的影響機(jī)制,為提高胚胎附植率提供借鑒。方法:本實(shí)驗(yàn)首先運(yùn)用半定量RT-PCR和實(shí)時(shí)熒光定量RT-PCR分別檢測21 d妊娠綿羊全身組織和妊娠第9 d、13 d、17 d、21 d、25 d綿羊子宮內(nèi)膜組織中TLR4基因的表達(dá)。其次,通過免疫組織化學(xué)和細(xì)胞免疫學(xué)抗體著色法檢測TLR4蛋白在早期妊娠綿羊(9 d、13 d、17 d、21 d、25 d)子宮組織中的分布與表達(dá),并利用VIM蛋白特異性檢測基質(zhì)細(xì)胞的完整性。最后,進(jìn)行構(gòu)建pcDNA3.1(+)-TLR4真核表達(dá)載體,用1μg·L~(-1)的LPS刺激轉(zhuǎn)染后的子宮內(nèi)膜基質(zhì)細(xì)胞,建立內(nèi)膜基質(zhì)細(xì)胞炎癥模型。利用熒光定量RT-PCR技術(shù)和蛋白質(zhì)免疫印跡Western Blot方法檢測受LPS刺激后的內(nèi)膜基質(zhì)細(xì)胞TLR4 mRNA表達(dá)量和TLR4蛋白表達(dá)量以及免疫因子IL-1β和IL-6的mRNA表達(dá)水平。結(jié)果:不僅發(fā)現(xiàn)TLR4基因在綿羊全身組織的輸卵管、卵巢、子宮、膀胱、脾臟及松果體中表達(dá)量較高,在肝臟、小腸、肌肉中表達(dá)較弱,而在心臟、垂體、脂肪等組織中不表達(dá),而且TLR4基因在子宮內(nèi)膜中的表達(dá)量從第9 d開始下降至附植點(diǎn)第17 d最低,之后上升到第25 d達(dá)到峰值。此外,TLR4基因不管是在中國美利奴羊還是在湖羊子宮內(nèi)膜組織中檢測,其黃體期的表達(dá)水平均顯著高于卵泡期(P0.05)。其次,TLR4蛋白在子宮內(nèi)膜各部位均有表達(dá),呈一定的動(dòng)態(tài)時(shí)空模式,且在第17 d的基質(zhì)細(xì)胞中表達(dá)尤為顯著,并鑒定出基質(zhì)細(xì)胞的完整性。最后成功構(gòu)建pcDNA3.1(+)-TLR4真核表達(dá)載體,并且發(fā)現(xiàn)LPS不僅降低了細(xì)胞中IL-6的表達(dá),增加了IL-1β的表達(dá),引起炎癥反應(yīng),使Th1/Th2偏向不利于妊娠的Th1方向,而且TLR4 mRNA表達(dá)量在12 h、24 h、48 h、72h顯著高于對(duì)照組(P0.05),其中48 h的表達(dá)極顯著(P0.01),TLR4蛋白表達(dá)量也始終高于對(duì)照組,與定量結(jié)果一致。結(jié)論:TLR4的表達(dá)具有組織特異性,且在綿羊胚胎附植期及發(fā)情周期的子宮內(nèi)膜中呈現(xiàn)一定規(guī)律,提示TLR4在綿羊繁殖期發(fā)揮一定作用。發(fā)現(xiàn)TLR4蛋白在胚胎附植早期子宮內(nèi)膜中的表達(dá)模式。LPS有效激活了子宮內(nèi)膜細(xì)胞中TLR4信號(hào)通路;子宮蛻膜組織TLR4受體蛋白對(duì)胚胎附植早期妊娠微環(huán)境的平衡維持起重要作用。
【學(xué)位授予單位】：石河子大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2018
【分類號(hào)】：S826
【圖文】：

TLR4 基因在綿羊胚胎附植期子宮內(nèi)膜的表達(dá)模式研究大多數(shù) TLRs 信號(hào)傳導(dǎo)中有著重要的作用。例如在 TLR2、TLR5、TLR7、TLR9[13]傳導(dǎo)途徑中，若有 MyD88 銜接蛋白的缺陷就會(huì)導(dǎo)致信號(hào)傳導(dǎo)受阻。而 TLR3 和 TL兩個(gè)比較特殊的 Toll 樣受體，TLR3 主要介導(dǎo) MyD88 非依賴型信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，當(dāng)yD88 也可以在 TLR3 的負(fù)調(diào)節(jié)中發(fā)揮功能[14]，TLR4 則可以同時(shí)介導(dǎo)這兩種傳導(dǎo)途如圖 1）。兩種不同的信號(hào)傳導(dǎo)途徑通過不同的通路，分別經(jīng)過一系列的信號(hào)傳導(dǎo)鏈 NF-kB，AP-1 或 IRF-3 等轉(zhuǎn)錄因子，最后進(jìn)入細(xì)胞核調(diào)節(jié)炎癥因子、細(xì)胞因子、共分子和細(xì)胞增殖、凋亡等基因的表達(dá)，從而啟動(dòng)先天性免疫和獲得性免疫系統(tǒng)[15]。

圖 2 非侵入型胚胎附植的時(shí)期變化Figure 2 Non-invasive implantation of non-decidualizing species我們以綿羊胚胎為例，它的附植過程也大致分為囊胚的孵化、自身的伸長、與子宮細(xì)胞的附植預(yù)接觸，還有胚胎的定位與黏附等幾個(gè)階段。而囊胚的孵化就標(biāo)志著胚母體子宮的一種分子對(duì)話，開始密切的信號(hào)聯(lián)系。通常在妊娠第6 d形成胚泡，第8 d突破透明帶孵出，胚胎便吸取滋養(yǎng)層細(xì)胞的營養(yǎng)劇烈生長，發(fā)生形態(tài)學(xué)變化。妊娠1 d由球形變?yōu)楣苄�，到�?2 d時(shí)長度可達(dá)10~22 mm，到17 d已達(dá)15 cm以上[45]。其中的第14 d，第一次出現(xiàn)雙核細(xì)胞，它是胚胎附植的典型標(biāo)志之一。但其功能尚未完楚，可能與合成催乳素、類固醇激素、妊娠蛋白等物質(zhì)有關(guān)（圖3）。另外，在綿羊的第13 d胚胎伸長的過程中滋養(yǎng)層細(xì)胞可形成指狀形突起，緊接著第14-15 d定位并附著于子宮，并在第17 d左右發(fā)生黏附附植，絨毛不斷生長至血管生成。同時(shí)合成妊娠蛋白、類固醇激素等物質(zhì)來調(diào)節(jié)母體生理內(nèi)環(huán)境，至妊娠第21 d附植基本完成。至第30 d胚胎滋養(yǎng)層絨毛與子宮阜的組織形成“母包子型”胎盤[46]，指狀突起也隨之。

其中妊娠的第14 d，第一次出現(xiàn)雙核細(xì)胞，它是胚胎附植的典型標(biāo)志之一。但其功能尚未完全清楚，可能與合成催乳素、類固醇激素、妊娠蛋白等物質(zhì)有關(guān)（圖3）。另外，在綿羊妊娠的第13 d胚胎伸長的過程中滋養(yǎng)層細(xì)胞可形成指狀形突起，緊接著第14-15 d定位并初步附著于子宮，并在第17 d左右發(fā)生黏附附植，絨毛不斷生長至血管生成。同時(shí)合成分泌妊娠蛋白、類固醇激素等物質(zhì)來調(diào)節(jié)母體生理內(nèi)環(huán)境，至妊娠第21 d附植基本完成。隨后至第30 d胚胎滋養(yǎng)層絨毛與子宮阜的組織形成“母包子型”胎盤[46]，指狀突起也隨之消失。圖 3 綿羊胚胎附植遷移模式及與母體血漿激素水平Figure 3 Migration model and plasma hormone levels in ovine embryo implantation

【參考文獻(xiàn)】

相關(guān)期刊論文 前10條

1 張誼;何自標(biāo);陳晨;鮮紅;張明;;TLR4在妊娠異常終止中的作用機(jī)制和研究進(jìn)展[J];中國畜牧獸醫(yī);2014年07期

2 王玉華;;子宮內(nèi)膜癌發(fā)病相關(guān)因素及治療進(jìn)展[J];醫(yī)學(xué)理論與實(shí)踐;2013年05期

3 熊q試

本文編號(hào)：2794423