【摘要】：犬瘟熱是由副黏病毒科麻疹病毒屬的犬瘟熱病毒(Canine distemper virus,CDV)引起的感染犬和浣熊等食肉動(dòng)物并呈世界范圍分布的一種傳染病。犬瘟熱具有高度的傳染性,嚴(yán)重影響?zhàn)B犬業(yè)和毛皮動(dòng)物養(yǎng)殖業(yè)的發(fā)展。CDV弱毒活疫苗的廣泛使用大大降低了犬瘟熱的爆發(fā),但仍有報(bào)道在已免疫過(guò)的犬中出現(xiàn)CDV的感染。傳統(tǒng)的CDV弱毒活疫苗的免疫效果易受母源抗體的干擾,此外不同易感動(dòng)物對(duì)這些疫苗的敏感性也有差異,可能導(dǎo)致接種動(dòng)物產(chǎn)生腦炎等不良反應(yīng)。因此,開(kāi)發(fā)一種安全、高效的CDV疫苗對(duì)控制犬瘟熱的流行至關(guān)重要。CDV作為一種不分節(jié)段的單股負(fù)鏈RNA病毒,可包裝容納和穩(wěn)定表達(dá)較大片段的外源蛋白的基因,在自然狀況下很少或不發(fā)生基因交換現(xiàn)象,上述生物學(xué)特性提示CDV可作為一個(gè)很好的疫苗載體。因此,本研究以實(shí)驗(yàn)室保存的CDV弱毒疫苗株CDV11為親本毒株,構(gòu)建了CDV11全長(zhǎng)cDNA感染性克隆pAC-CDV11,并成功拯救出重組犬瘟熱病毒rCDV11,建立了該毒株的反向遺傳操作平臺(tái)。rCDV11在Vero細(xì)胞上的感染能力和生長(zhǎng)特性與母本病毒株CDV11無(wú)顯著差異。為了找到合適的CDV11載體外源基因插入位點(diǎn),我們將綠色熒光蛋白(Green Fluorescent Protein,GFP)基因插入CDV11基因組不同基因之間的非編碼區(qū),拯救出各重組犬瘟熱病毒,評(píng)估不同位置表達(dá)外源蛋白的能力。結(jié)果發(fā)現(xiàn),將GFP基因插入CDV11基因組P-M基因之間非編碼區(qū)的重組犬瘟熱病毒rCDV-P/GFP/M在Vero細(xì)胞上的生長(zhǎng)特性與親本株rCDV11相似,能穩(wěn)定、高效的表達(dá)GFP,具有良好的遺傳穩(wěn)定性。結(jié)果表明CDV弱毒疫苗株CDV11具有作為活疫苗載體表達(dá)外源蛋白的潛力,P-M基因之間非編碼區(qū)可作為一個(gè)較好的外源基因插入位點(diǎn)。白介素-7(Interleukin-7,IL-7)作為一種細(xì)胞因子,參與調(diào)控淋巴細(xì)胞生長(zhǎng)發(fā)育,在多種病毒誘導(dǎo)的免疫反應(yīng)過(guò)程中發(fā)揮著重要作用。接下來(lái),我們構(gòu)建了表達(dá)鼠源IL-7的重組犬瘟熱病毒rCDV-IL7,rCDV-IL7在Vero細(xì)胞中的生長(zhǎng)特性與親本株rCDV11無(wú)顯著差異,表明IL-7的表達(dá)不影響重組犬瘟熱病毒的復(fù)制和擴(kuò)散。將rCDV-IL7在Vero細(xì)胞上連續(xù)傳10代,各代次病毒滴度均介于10~(6.0)-10~6.5.5 TCID_(50)/mL之間,且能穩(wěn)定表達(dá)IL-7,表明重組犬瘟熱病毒rCDV-IL7在Vero細(xì)胞中具有良好的遺傳穩(wěn)定性。酶聯(lián)免疫吸附實(shí)驗(yàn)(Enzyme-linked immunosorbent assay,ELISA)檢測(cè)結(jié)果表明重組犬瘟熱病毒rCDV-IL7可在Vero細(xì)胞中表達(dá)IL-7且具有劑量依賴性。細(xì)胞活性檢測(cè)結(jié)果表明IL-7的表達(dá)對(duì)Vero細(xì)胞無(wú)明顯毒副作用。為研究重組犬瘟熱病毒對(duì)小鼠的致病性,分別將重組病毒rCDV-IL7和rCDV11經(jīng)腦部途徑和肌肉途徑感染小鼠,所有感染重組犬瘟熱病毒的小鼠均未出現(xiàn)犬瘟熱臨床癥狀,與對(duì)照組相比,小鼠體重變化均無(wú)顯著性差異。結(jié)果表明IL-7的表達(dá)沒(méi)有增加rCDV11對(duì)小鼠的致病性。為進(jìn)一步研究rCDV-IL7的免疫原性,將重組病毒rCDV-IL7和rCDV11分別按1×10~5 TCID_(50)/100μL/只的劑量,肌肉途徑免疫小鼠,在初次免疫3 w后以相同途徑、相同劑量再次免疫小鼠。初次免疫后連續(xù)10 w檢測(cè)小鼠體內(nèi)CDV中和抗體水平。結(jié)果發(fā)現(xiàn)兩組小鼠在加強(qiáng)免疫后,免疫反應(yīng)迅速增強(qiáng),與rCDV11相比,rCDV-IL7可誘導(dǎo)小鼠產(chǎn)生更高滴度的中和抗體。綜上所述,我們成功建立了CDV弱毒疫苗株CDV11的反向遺傳學(xué)系統(tǒng),并構(gòu)建了表達(dá)IL-7的重組犬瘟熱病毒rCDV-IL7。重組犬瘟熱病毒rCDV-IL7具有良好的生物安全性和免疫原性,可刺激小鼠產(chǎn)生高水平的CDV中和抗體,有望成為一株安全高效的犬瘟熱病毒疫苗株。
【學(xué)位授予單位】：華中農(nóng)業(yè)大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2018
【分類號(hào)】：S852.65
【圖文】：

華中農(nóng)業(yè)大學(xué) 2018 屆碩士研究生學(xué)位（畢業(yè)）論文核苷酸組成，5’端前導(dǎo)（尾隨）序列大約由 38 個(gè)核苷酸組成(Haig 19a et al 2006)。V 只有一種血清型，依據(jù) H 蛋白的多樣性，可分為幾種基因型，分別型、美國(guó) II 型、亞洲 I 型、亞洲 II 型、歐洲野生型、歐洲和南美 I 型、、南美 III 型等(Ke et al 2015；Panzera et al 2015)。H 基因序列分析發(fā)生了與 CDV 地理區(qū)域相關(guān)的遺傳漂變。機(jī)體可以針對(duì) H 蛋白產(chǎn)生適當(dāng)應(yīng)來(lái)清除 CDV 的感染，這使得 H 蛋白可作為一個(gè)合適的靶標(biāo)來(lái)研究基與分子流行病學(xué)(Budaszewski Rda et al 2014；Hashimoto et al 2001)。

00 marker;A:3192bp; B:3185bp; C:3150bp; D:3131bp; 圖 3-2 CDV11 全長(zhǎng)分段 PCR 結(jié)果Fig.3-2 PCR result of five fragments圖 3-3 pAC-CDV11 的構(gòu)建示意圖

30圖 3-3 pAC-CDV11 的構(gòu)建示意圖Fig.3-3 Schematic diagram for the construction of pAC-CDV11.2 病毒的拯救由于 BHK-21 細(xì)胞不表達(dá) T7 RNA 聚合酶，額外轉(zhuǎn)染了表達(dá) T7 RNA 聚合酶粒 pCAGGS-T7。采用磷酸鈣轉(zhuǎn)染的方法，將 pCAGGS-T7、pAC-CDV11、NA3.1(+)-CDVN、pcDNA3.1(+)-CDVP和pcDNA3.1(+)-CDVL共轉(zhuǎn)染BHK-2。轉(zhuǎn)染 2-3d 后，取 300μL 細(xì)胞上清接種于 6 孔板中細(xì)胞匯合度約為 70%-80% Vero-DST 細(xì)胞中。待 Vero-DST 細(xì)胞出現(xiàn)病變時(shí)，收獲病毒液，作為獲救的 P0 代。提取出現(xiàn)病變細(xì)胞的 RNA，通過(guò) RT-PCR 對(duì)獲救病毒 rCDV11 進(jìn)

【參考文獻(xiàn)】

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本文編號(hào)：2794058