【摘要】：牦牛是藏區(qū)牧民重要的家畜,但其繁殖能力低,通常兩年一胎或三年兩胎,在其整個(gè)生命周期中高產(chǎn)者僅能產(chǎn)仔四到五頭。在牧草較為豐盛的條件下牦牛的發(fā)情期也較短,牦牛發(fā)情只有一到二天,這樣低的繁殖力遠(yuǎn)遠(yuǎn)滿足不了牧民的需求,同時(shí)也制約著牦牛種群的擴(kuò)大。而且受自然條件和技術(shù)手段限制,其調(diào)控繁殖相關(guān)分子研究較少且不全面。因此,尋找牦牛繁殖調(diào)控相關(guān)分子標(biāo)志物,解決其低繁殖力是亟待解決的重要問(wèn)題。為了更深入研究牦牛生殖生理分子調(diào)控機(jī)制,進(jìn)一步提高其繁殖力,本研究使用Label-free蛋白質(zhì)組學(xué)定量方法篩選牦牛黃體期和卵泡期卵巢的差異表達(dá)蛋白,并運(yùn)用生物信息學(xué)分析這些差異表達(dá)蛋白質(zhì)的功能及參與生物學(xué)過(guò)程或代謝途徑。同時(shí)運(yùn)用QRT-PCR、Western blot及免疫組化技術(shù),對(duì)采集的卵巢、子宮、輸卵管中差異表達(dá)蛋白進(jìn)行定量、定性和定位研究,以期找出可能影響牦牛生殖的差異蛋白及其定位表達(dá),實(shí)驗(yàn)結(jié)果如下:(1)采用Label-free蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)分析牦牛黃體期和卵泡期卵巢組織蛋白的變化,篩選兩個(gè)時(shí)期的差異表達(dá)蛋白,結(jié)果顯示:在黃體期鑒定到2867個(gè)蛋白,卵泡期鑒定到2180個(gè)蛋白,有2011個(gè)蛋白在這兩個(gè)時(shí)期中均表達(dá),856個(gè)蛋白只在黃體期表達(dá),169個(gè)蛋白只在卵泡期表達(dá)。差異表達(dá)蛋白63個(gè)(P0.05),其中黃體期較卵泡期有47個(gè)蛋白表達(dá)上調(diào),16個(gè)蛋白表達(dá)下調(diào)。(2)對(duì)篩選出的差異表達(dá)蛋白進(jìn)行生物信息學(xué)分析,Go分析結(jié)果表明差異表達(dá)蛋白主要分布在細(xì)胞膜和胞外區(qū)部分,主要功能體現(xiàn)在粘連活性方面;對(duì)所鑒定出的卵巢差異表達(dá)蛋白進(jìn)行了COG分析,結(jié)果發(fā)現(xiàn)參與翻譯、核糖體結(jié)構(gòu)和生物發(fā)生、RNA加工和修飾、轉(zhuǎn)錄、生物信號(hào)通路轉(zhuǎn)導(dǎo)、翻譯后修飾、蛋白質(zhì)周轉(zhuǎn)、分子伴侶、代謝等蛋白質(zhì)均出現(xiàn),其中出現(xiàn)頻數(shù)最高的蛋白質(zhì)為發(fā)揮生物信號(hào)通路轉(zhuǎn)導(dǎo)機(jī)制的蛋白質(zhì)類,而出現(xiàn)頻數(shù)最低的蛋白質(zhì)則為參與細(xì)胞運(yùn)動(dòng)的蛋白質(zhì);通過(guò)KEGG分析這些差異蛋白主要參與類固醇生物合成、趨化因子信號(hào)通路、蛋白質(zhì)在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中的加工、甘油磷脂代謝、碳代謝、PI3K-Akt信號(hào)通路、PPAR信號(hào)通路、NOD樣受體信號(hào)通路、嘌呤代謝途徑、RNA運(yùn)輸途徑、胰臟分泌代謝途徑、RNA降解代謝途徑、HIF-1信號(hào)通路、AMPK信號(hào)通路、胰島素信號(hào)通路、鈣離子信號(hào)通路、谷胱甘肽代謝等途徑。(3)QRT-PCR與Western blot驗(yàn)證了FSHR、LHR、St AR、Rab-8a、HSP105在牦牛黃體期與卵泡期的卵巢、子宮及輸卵管組織中的表達(dá)。結(jié)果表明:FSHR、St AR、HSP105在卵泡期表達(dá)量明顯高于黃體期,而LHR和Rab-8a則在黃體期呈現(xiàn)上調(diào)。FSHR在黃體期卵巢、子宮、輸卵管中呈現(xiàn)出明顯的下調(diào)作用;LHR在黃體期卵巢、子宮、輸卵管中均呈現(xiàn)上調(diào);黃體期與卵泡期相比,St AR在卵泡期卵巢組織中的表達(dá)是黃體期的5.05倍,在子宮中的表達(dá)是黃體期2.38倍,差異極顯著(P0.01),在輸卵管中的表達(dá)是黃體期的1.82倍,差異顯著(P0.05);Rab-8a在卵巢、子宮、輸卵管中的表達(dá)卵泡期均低于黃體期,差異顯著(P0.05);HSP105在卵巢、子宮、輸卵管中的表達(dá)黃體期均低于卵泡期(P0.05)。(4)免疫組化結(jié)果顯示:在黃體期,FSHR主要在卵巢顆粒細(xì)胞層、子宮固有膜的結(jié)締組織以及輸卵管的黏膜上皮細(xì)胞呈陽(yáng)性表達(dá);LHR主要在卵巢卵泡顆粒細(xì)胞層、子宮的黏膜上皮細(xì)胞及輸卵管的黏膜上皮細(xì)胞呈陽(yáng)性表達(dá);St AR主要在卵巢閉鎖卵泡的顆粒細(xì)胞層和輸卵管的黏膜上皮有弱陽(yáng)性表達(dá),但在子宮中未見(jiàn)表達(dá);Rab-8a主要在卵巢閉鎖卵泡顆粒層細(xì)胞、子宮和輸卵管的黏膜上皮有弱陽(yáng)性表達(dá);HSP105主要在卵巢的結(jié)締組織和髓質(zhì)區(qū)動(dòng)脈血管的肌層、子宮和輸卵管的黏膜上皮有陽(yáng)性表達(dá)。在卵泡期,FSHR主要在卵巢的卵泡顆粒細(xì)胞層、子宮的黏膜上皮以及黏膜固有層的結(jié)締組織和子宮腺上皮細(xì)胞,以及輸卵管的黏膜上皮細(xì)胞均有陽(yáng)性表達(dá);LHR主要在卵巢的生殖上皮和初級(jí)卵泡、子宮的黏膜上皮細(xì)胞以及固有層的結(jié)締組織和子宮腺上皮細(xì)胞,以及輸卵管的黏膜上皮中均呈陽(yáng)性表達(dá);St AR主要是在卵巢的卵泡顆粒細(xì)胞層、子宮黏膜固有層的子宮腺上皮和結(jié)締組織以及輸卵管的黏膜上皮內(nèi)均有陽(yáng)性表達(dá);Rab-8a主要是在卵巢的卵泡顆粒細(xì)胞層、子宮黏膜固有層的結(jié)締組織及輸卵管的黏膜層上皮內(nèi)有弱陽(yáng)性表達(dá);HSP105主要是在卵巢的卵泡顆粒細(xì)胞層、子宮黏膜固有層的子宮腺上皮和輸卵管的黏膜上皮中均有陽(yáng)性表達(dá)。
【學(xué)位授予單位】：甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2018
【分類號(hào)】：S823.85
【圖文】：

圖 1 細(xì)胞培養(yǎng)氨基酸穩(wěn)定同位素標(biāo)記原理Figure 1 Principle of stable isotope labeling of amino acid in cell culture譜多反應(yīng)監(jiān)測(cè)技術(shù)（MRM）作為一種目標(biāo)蛋白組定量技術(shù)，其主要依為三重四級(jí)桿質(zhì)譜[28]。首先使用液相分離蛋白質(zhì)，通過(guò)霧化器對(duì)電離蛋賦予電荷，再使用碰撞誘導(dǎo)分離母離子，最終使用三重四極質(zhì)譜儀對(duì)單子進(jìn)行掃描（圖 2）。MRM 被用于鑒定野生型和突變型蛋白質(zhì)的差別于其高精準(zhǔn)度故而可以用來(lái)精準(zhǔn)定量，也可以用來(lái)回答關(guān)于單個(gè)細(xì)胞中絕對(duì)拷貝數(shù)的基本問(wèn)題，其中在哺乳動(dòng)物細(xì)胞和人體的數(shù)字建模以及腫異常蛋白的相對(duì)水平中是必不可少的，并且對(duì)于診斷有很重要的作用 也被用作觸發(fā)肽的完整產(chǎn)物離子掃描的方法，可以檢測(cè)低于檢測(cè)極限的后修飾[29, 30]的標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)譜分析[31]。2017 年，MRM 已發(fā)展成為一種高度重復(fù)的基于質(zhì)譜的蛋白質(zhì)靶向檢測(cè)平臺(tái)，并且已經(jīng)證明基于 MRM 的在白質(zhì)組學(xué)應(yīng)用方面優(yōu)于傳統(tǒng)的基于抗體的蛋白質(zhì)生物標(biāo)志物診斷

Figure 1 Principle of stable isotope labeling of amino acid in cell culture質(zhì)譜多反應(yīng)監(jiān)測(cè)技術(shù)（MRM）作為一種目標(biāo)蛋白組定量技術(shù)，其主要依靠的儀器為三重四級(jí)桿質(zhì)譜[28]。首先使用液相分離蛋白質(zhì)，通過(guò)霧化器對(duì)電離蛋白質(zhì)樣品賦予電荷，再使用碰撞誘導(dǎo)分離母離子，最終使用三重四極質(zhì)譜儀對(duì)單一的母離子進(jìn)行掃描（圖 2）。MRM 被用于鑒定野生型和突變型蛋白質(zhì)的差別，同時(shí)由于其高精準(zhǔn)度故而可以用來(lái)精準(zhǔn)定量，也可以用來(lái)回答關(guān)于單個(gè)細(xì)胞中蛋白質(zhì)的絕對(duì)拷貝數(shù)的基本問(wèn)題，其中在哺乳動(dòng)物細(xì)胞和人體的數(shù)字建模以及腫瘤中遺傳異常蛋白的相對(duì)水平中是必不可少的，并且對(duì)于診斷有很重要的作用。MRM 也被用作觸發(fā)肽的完整產(chǎn)物離子掃描的方法，可以檢測(cè)低于檢測(cè)極限的特定翻譯后修飾[29, 30]的標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)譜分析[31]。2017 年，MRM 已發(fā)展成為一種高度靈敏且可重復(fù)的基于質(zhì)譜的蛋白質(zhì)靶向檢測(cè)平臺(tái)，并且已經(jīng)證明基于 MRM 的在臨床蛋白質(zhì)組學(xué)應(yīng)用方面優(yōu)于傳統(tǒng)的基于抗體的蛋白質(zhì)生物標(biāo)志物診斷如ELISA[32]。

而選擇更合適的胚泡轉(zhuǎn)移時(shí)期。胚胎的蛋白質(zhì)組學(xué)研究也在低級(jí)物種，例如斑馬魚(yú)中進(jìn)行。這種模式生物體研究破譯脊椎動(dòng)物發(fā)育中的調(diào)節(jié)網(wǎng)絡(luò)時(shí)是有用的，但對(duì)于高等生物是不可能。因此，從它們獲得的結(jié)果來(lái)推斷哺乳動(dòng)物的生殖應(yīng)謹(jǐn)慎對(duì)待[71]。 卵泡刺激素和黃體生成素的生理學(xué)意義卵泡刺激素（follicle-stimulating hormone，F(xiàn)SH）是由垂體前葉嗜堿性細(xì)胞泌和合成的一種由 α 和 β 兩個(gè)亞基組成的異質(zhì)二聚體組成的糖蛋白激素，β 亞與 α 亞基集合才能發(fā)揮 FSH 的生物學(xué)活性見(jiàn)圖 3[95, 96]。FSHβ 亞基氮端長(zhǎng)度不致，故而 FSH 具有種屬差異。FSH 臨床上用于雌性動(dòng)物，調(diào)控其發(fā)情周期使發(fā)情，或是在排卵期前促進(jìn)卵泡和卵子的發(fā)育，從而促進(jìn)排卵以達(dá)到體內(nèi)受精目的。Roker 和 Richards 等人證明 FSH 對(duì)于生育發(fā)育有重要的意義，主要功能引起卵泡的發(fā)育[13]，一定量的 FSH 可以抑制早期卵泡的閉鎖[14]。

【相似文獻(xiàn)】

相關(guān)期刊論文 前10條

1 王勁松;左琴;范濤;李保文;;卵巢組織玻璃化冷凍的研究進(jìn)展[J];中國(guó)比較醫(yī)學(xué)雜志;2014年12期

2 邢冠琳;孫瑩璞;;卵巢組織冷凍和體外培養(yǎng)的現(xiàn)狀及展望[J];國(guó)外醫(yī)學(xué)(計(jì)劃生育/生殖健康分冊(cè));2007年03期

3 韓海艷;周穎;;冷凍卵巢組織應(yīng)用的研究進(jìn)展[J];國(guó)外醫(yī)學(xué)(計(jì)劃生育/生殖健康分冊(cè));2006年03期

4 莫中福;呂曉梅;呂英璞;徐素欣;;不同時(shí)期婦女卵巢組織中bFGF免疫組化的研究[J];臨床和實(shí)驗(yàn)醫(yī)學(xué)雜志;2006年05期

5 徐安然;晁嵐;甄軍暉;于紅玲;鄧曉惠;;兔冷凍卵巢組織自體多點(diǎn)種植后的組織形態(tài)和功能[J];山東大學(xué)學(xué)報(bào)(醫(yī)學(xué)版);2006年10期

6 李梅,李媛;卵巢組織冷凍保存及其應(yīng)用的研究進(jìn)展[J];現(xiàn)代婦產(chǎn)科進(jìn)展;2001年04期

7 張更利;;牛傳染性鼻氣管炎病毒感染引起卵巢損害[J];青海畜牧獸醫(yī)雜志;1988年01期

8 ;卵巢組織凍存與移植中國(guó)專家共識(shí)[J];中國(guó)臨床醫(yī)生雜志;2018年04期

9 姚桂東;孫瑩璞;;卵巢組織冷凍復(fù)蘇及移植[J];實(shí)用婦產(chǎn)科雜志;2016年04期

10 鄭華;鄧曉惠;于璇;于紅玲;李瑞昌;劉文君;;大鼠凍存卵巢組織自體異位移植后長(zhǎng)期功能評(píng)估[J];解剖學(xué)報(bào);2009年03期

相關(guān)會(huì)議論文 前10條

1 張紅;;卵巢組織冷凍保存及其應(yīng)用[A];中國(guó)中藥雜志2015/專集：基層醫(yī)療機(jī)構(gòu)從業(yè)人員科技論文寫(xiě)作培訓(xùn)會(huì)議論文集[C];2016年

2 邢衛(wèi)杰;李予;王文軍;麥美琪;楊冬梓;張清學(xué);;血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子對(duì)大鼠卵巢組織自體移植后的形態(tài)與功能的影響[A];第二屆全國(guó)不育癥研討會(huì)論文匯編[C];2007年

3 于璇;鄧曉;晁嵐;于紅玲;;玻璃化冷凍卵巢組織自體移植后卵巢功能觀察[A];中華醫(yī)學(xué)會(huì)第十次全國(guó)婦產(chǎn)科學(xué)術(shù)會(huì)議婦科內(nèi)分泌會(huì)場(chǎng)（婦科內(nèi)分泌學(xué)組、絕經(jīng)學(xué)組、計(jì)劃生育學(xué)組）論文匯編[C];2012年

4 趙碩;趙淑琴;時(shí)慶;秦曉敏;韓亦龍;晁嵐;鄧曉惠;;兩種冷凍方法對(duì)人大塊卵巢組織卵泡活性的影響[A];中華醫(yī)學(xué)會(huì)第十次全國(guó)婦產(chǎn)科學(xué)術(shù)會(huì)議婦科內(nèi)分泌會(huì)場(chǎng)（婦科內(nèi)分泌學(xué)組、絕經(jīng)學(xué)組、計(jì)劃生育學(xué)組）論文匯編[C];2012年

5 池海虹;周穎;;激活素A對(duì)凍融人胎兒卵巢組織原始卵泡體外發(fā)育的影響[A];2008年浙江省婦產(chǎn)科學(xué)學(xué)術(shù)年會(huì)暨浙江省醫(yī)師協(xié)會(huì)婦產(chǎn)科醫(yī)師分會(huì)成立大會(huì)論文匯編[C];2008年

6 周穎;;人卵巢組織冷凍保存和體外發(fā)育的實(shí)驗(yàn)研究[A];第二屆全國(guó)不育癥研討會(huì)論文匯編[C];2007年

7 王靜芬;;體外培養(yǎng)對(duì)卵巢組織異種移植的影響[A];2014浙江省婦產(chǎn)科學(xué)、圍產(chǎn)醫(yī)學(xué)學(xué)術(shù)年會(huì)暨婦產(chǎn)科常見(jiàn)疾病規(guī)范化治療新進(jìn)展、圍產(chǎn)醫(yī)學(xué)現(xiàn)狀與進(jìn)展專題學(xué)術(shù)論壇論文匯編[C];2014年

8 吳丹丹;徐炳森;童月紅;黃學(xué)鋒;林金葡;周穎;;丹參對(duì)凍融人胎兒卵巢組織異種移植早期血管生成的影響[A];第二屆全國(guó)不育癥研討會(huì)論文匯編[C];2007年

9 蔡玉芳;王燕蓉;孔斌;崔岫;沈新生;;β-巰基乙醇和枸杞多糖對(duì)胎兒卵巢組織冷凍保存的影響[A];中國(guó)解剖學(xué)會(huì)2012年年會(huì)論文文摘匯編[C];2012年

10 張曉明;金松君;相建海;;海鞘(Ciona Savignyi)卵巢組織細(xì)胞的原代培養(yǎng)和傳代[A];中國(guó)海洋湖沼學(xué)會(huì)第九次全國(guó)會(huì)員代表大會(huì)暨學(xué)術(shù)研討會(huì)論文摘要匯編[C];2007年

相關(guān)重要報(bào)紙文章 前10條

1 華新;科學(xué)家利用實(shí)驗(yàn)鼠培育成功人類卵子[N];中國(guó)醫(yī)藥報(bào);2000年

2 楊鋒;“卵巢保養(yǎng)”能葆青春?jiǎn)醄N];中國(guó)醫(yī)藥報(bào);2003年

3 毛磊;卵巢凍存為癌癥患者提供生育希望[N];中國(guó)醫(yī)藥報(bào);2003年

4 紫藤;移植孿生姐卵巢組織的婦女生育[N];中國(guó)醫(yī)藥報(bào);2005年

5 楊 昆;打破卵巢“美容”的神話[N];中國(guó)中醫(yī)藥報(bào);2003年

6 ;人造卵巢或助癌癥患者懷孕[N];健康報(bào);2018年

7 記者 曹麗君;美科學(xué)家利用冷凍人類卵巢組織首次培育出胚胎[N];新華每日電訊;2004年

8 曹麗君;冷凍卵巢組織可培育出胚胎[N];中國(guó)醫(yī)藥報(bào);2004年

9 文心;癌癥患者有望保留生育功能[N];醫(yī)藥經(jīng)濟(jì)報(bào);2003年

10 曹麗君;冷凍卵巢組織培育出胚胎[N];上�？萍紙�(bào);2004年

相關(guān)博士學(xué)位論文 前10條

1 郭淼;蛋雞卵巢組織中ERα動(dòng)態(tài)變化的表觀調(diào)控及所調(diào)節(jié)基因的篩選[D];山東農(nóng)業(yè)大學(xué);2017年

2 陳虹;牦牛卵巢Label-free蛋白組學(xué)分析及相關(guān)蛋白在生殖系統(tǒng)的表達(dá)[D];甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué);2018年

3 王利紅;人卵巢組織冷凍保存的實(shí)驗(yàn)研究[D];山東大學(xué);2005年

4 趙曉徽;大鼠卵巢組織冷凍保存和自體移植的研究[D];天津醫(yī)科大學(xué);2007年

5 晁嵐;兔卵巢組織冷凍復(fù)蘇后自體移植的實(shí)驗(yàn)研究[D];山東大學(xué);2008年

6 李s

本文編號(hào)：2794027