發(fā)布時間：2020-08-12 13:13

【摘要】：近年來,隨著人們對食品安全及生態(tài)環(huán)境的關(guān)注度不斷提高,抗生素殘留和細菌耐藥性等問題也逐漸暴露出來,抗生素的禁用將會是畜牧獸醫(yī)行業(yè)發(fā)展的必然趨勢。因此,尋求開發(fā)綠色、安全的替代抗生素的飼料添加劑刻不容緩。姜黃素(Curcumin,Cur)是從中藥姜黃中提取的一種酚類物質(zhì),作為一種多效的天然活性成分,姜黃素有希望取代抗生素,在畜禽“無抗養(yǎng)殖”中發(fā)揮重要作用。雖然長期以來姜黃素作為一種常用的天然色素,已被廣泛地應(yīng)用在食品工業(yè)中,但其在畜牧獸醫(yī)生產(chǎn)中的應(yīng)用性研究相對較少,尤其是在減少畜禽脂肪沉積效果方面的研究更少。本研究以原代培養(yǎng)的豬前體脂肪細胞和小鼠3T3-L1前體脂肪細胞系為體外模型,探討姜黃素對脂肪細胞增殖和成脂分化的影響,并以高脂日糧誘導的C57BL/6J肥胖小鼠為體內(nèi)模型,深入探討姜黃素對小鼠脂肪沉積的調(diào)控作用及對高脂飲食誘導小鼠肥胖的抑制效果。研究結(jié)果將為姜黃素作為安全、有效的飼料添加劑在畜牧獸醫(yī)生產(chǎn)上的應(yīng)用提供科學依據(jù)。實驗一、姜黃素對小鼠3T3-L1前體脂肪細胞增殖和成脂分化的作用研究將小鼠3T3-L1前體脂肪細胞進行增殖培養(yǎng),待細胞達到80%-90%融合時,利用含終濃度為 0.1 mmol/L3-異丁基-1-甲基黃嘌呤(IBMX),2.5 μμmol/L地塞米松(DEX),1 μg/mL胰島素(Insulin)和2 μmol/L羅格列酮的誘導分化液I對細胞進行誘導分化,同時添加不同濃度姜黃素處理,共分為6組:①未誘導分化組(None,完全培養(yǎng)基);②誘導分化對照組(DM,誘導分化液+姜黃素溶解試劑DMSO);③誘導分化液+2.5 μμmol/L姜黃素組(DM+2.5μmol/LCur);④誘導分化液+5μmol/L 姜黃素組(DM+5μmol/LCur);⑤誘導分化液+10 μmol/L姜黃素組(DM+10 μmol/L Cur);⑥誘導分化液+15 μmol/L姜黃素組(DM+15 μmol/L Cur);3天后,更換只含有1 μg/mL Insulin的誘導分化液II進行處理,2天換液一次,6天后(共處理9天)在顯微鏡下觀察細胞成脂分化情況,采用CCK法檢測細胞增殖活力,通過油紅O染色和甘油三酯(TG)定量試劑盒檢測細胞內(nèi)TG含量,通過甘油含量測定試劑盒和小鼠游離脂肪酸(FFA)ELISA檢測試劑盒測定細胞上清中甘油和FFA的含量,通過以上指標綜合評價姜黃素對小鼠3T3-L1前體脂肪細胞增殖和成脂分化的影響。此外,通過熒光定量PCR(q-PCR)法進一步檢測姜黃素對3T3-L1細胞成脂分化相關(guān)基因表達的影響,初步闡明姜黃素影響3T3-L1細胞成脂分化的可能機制。研究結(jié)果顯示,與DM組相比,2.5、5、10、15 μmol/L姜黃素處理對細胞活力無顯著影響,而20 μmol/L姜黃素處理能顯著抑制細胞增殖活力。顯微鏡下觀察發(fā)現(xiàn),與DM組相比,2.5、5、10、15μmol/L姜黃素處理組細胞脂滴沉積量顯著降低,油紅O染色結(jié)果表明,與DM組相比,姜黃素處理組紅染陽性細胞明顯減少,TG沉積量顯著下降,并且呈劑量依賴性抑制作用;此外,姜黃素處理組細胞上清中甘油和FFA釋放量也呈劑量依賴性抑制作用。以上結(jié)果表明,姜黃素處理能在一定程度上抑制3T3-L1前體脂肪細胞的增殖和成脂分化,呈劑量依賴性。q-PCR的結(jié)果顯示,姜黃素處理能顯著抑制脂肪細胞分化關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子C/EBP-α、PPAR-γ和C/EBP-β,脂肪合成標志基因FAS、SCD和aP2的mRNA表達,并顯著增加脂肪分解標志基因ATGL mRNA表達。以上結(jié)果說明姜黃素抑制3T3-L1細胞脂質(zhì)沉積,一方面與抑制成脂分化、減少脂肪合成有關(guān)外,另一方面還可能與脂肪分解的增強有關(guān)。實驗二、姜黃素對豬前體脂肪細胞增殖和成脂分化的作用研究分離斷奶仔豬頸、背部皮下脂肪組織,采用Ⅰ型膠原酶分離前體脂肪細胞,細胞達到80%-90%融合時,使用含終濃度為 0.1 mmol/LIBMX,2.5μμmol/LDEX,1μg/mLInsulin 和2 μmol/L羅格列酮的誘導分化液進行成脂分化誘導,并同時添加姜黃素處理,根據(jù)姜黃素濃度的不同,共分為5組:①誘導分化對照組(DM,誘導分化液+DMSO);②誘導分化液+2.5μmol/L姜黃素組(DM+2.5μmol/LCur);③誘導分化液+5 μmol/L姜黃素組(DM+5 μmol/L Cur);④誘導分化液+10 μmol/L姜黃素組(DM+10 μmol/L Cur);⑤誘導分化液+15 μmol/L姜黃素組(DM-+15 μmol/LCur);利用CCK法檢測細胞增殖活力,通過油紅O染色法檢測細胞內(nèi)TG含量,采用q-PCR方法檢測脂肪細胞分化關(guān)鍵基因PPAR-γ和C/EBP-β、脂肪合成關(guān)鍵酶FAS和ACC以及脂肪分解限速酶HSL,ATGL和LPL的mRNA表達。應(yīng)用酶化學法測定細胞內(nèi)脂肪分解酶的酶活。CCK檢測結(jié)果顯示,與DM對照組細胞相比,2.5、5、10 μmol/L姜黃素處理48 h和72 h對原代培養(yǎng)的豬前體脂肪細胞增殖活力無顯著影響,但20 μmol/L姜黃素處理48 h和72 h均顯著抑制了細胞的增殖活力。油紅O染色結(jié)果表明,與DM組細胞相比,10μmol/L姜黃素處理48 h和72 h極顯著降低了細胞內(nèi)TG含量。顯微鏡下觀察也發(fā)現(xiàn),與DM對照組細胞相比,10 μmol/L姜黃素處理組細胞脂滴沉積量明顯減少,表明姜黃素對豬前體脂肪細胞的增殖和成脂分化也有一定的抑制作用,并且呈劑量、時間依賴性。q-PCR的結(jié)果表明,與DM組細胞相比,10μmol/L姜黃素處理能顯著降低脂肪分化成脂過程中兩個重要轉(zhuǎn)錄因子PPAR-γ和C/EBP-β的mRNA表達,此外,脂肪合成過程中兩個重要的合成酶ACC和FAS的mRNA表達也顯著下降;另外,姜黃素處理能顯著升高脂肪分解限速酶HSL和ATGL的mRNA表達量和酶活。此外,10 μmol/L姜黃素處理能顯著增加自噬標志基因LC3和溶酶體酸性脂肪酶LIPA的mRNA表達,并能顯著增加LC3蛋白的表達及LC3II/LC3I的比值。以上結(jié)果表明,姜黃素抑制豬前體脂肪細胞的成脂分化可能與脂肪合成的抑制及脂肪分解的增強有關(guān),還可能跟自噬激活機制有關(guān)。實驗三、日糧中添加姜黃素對高脂日糧誘導的C57BL/6J肥胖小鼠模型脂肪沉積的影響選取60只飼養(yǎng)環(huán)境、遺傳背景等相似的C57BL/6J雄性小鼠(4周齡,15-17 g),隨機均分成5組,分別飼喂標準日糧(Normaldiet,ND)、高脂日糧(Highfatdiet,HFD)、高脂日糧和0.1%姜黃素(HFD+0.1%Cur)、高脂日糧和0.5%姜黃素(HFD+0.5%Cur)及高脂日糧和1%姜黃素(HFD+1%Cur),飼喂12周。記錄每周體重(Body weight,BW)與采食量;在第4、8、12周分別進行口服葡萄糖耐受試驗(Oral glucose tolerance test,OGTT)并計算曲線下面積(AUC)。試驗結(jié)束時,記錄小鼠體重、附睪脂肪重量,并計算體重增長量及附睪脂肪重量/體重比值,記錄肝臟、心臟、脾臟、腎臟、睪丸、腓腸肌及比目魚肌的重量并計算器官和體重比。檢測血漿中脂代謝相關(guān)生化指標含量,并通過HE染色法檢測附睪脂肪和肝臟組織中脂滴沉積量,并對心臟、脾臟和腎臟組織樣等進行病理學分析。研究結(jié)果顯示,與HFD組小鼠相比,HFD+Cur處理能顯著降低小鼠體重、小鼠體重增長值、并能顯著抑制小鼠附睪脂肪組織重及附睪脂肪與體重比,并且呈劑量依賴性抑制作用。此外,HFD與HFD+Cur組小鼠的采食量和飼料利用率無顯著差異。相對器官重量統(tǒng)計結(jié)果顯示,與HFD組小鼠相比,HFD+Cur處理對肝臟、心臟、脾臟、腎臟、睪丸、腓腸肌、睪丸的重量并無顯著影響,但能顯著增加比目魚肌重量以及肝臟/體重和比目魚肌重/體重。OGTT實驗結(jié)果顯示,與HFD組小鼠相比,HFD+0.1%Cur、HFD+0.5%Cur和HFD+1%Cur處理能不同程度抑制血糖濃度,并顯著抑制AUC值,且呈劑量依賴性抑制作用。血液生化指標顯示,低濃度Cur就能顯著抑制LDL-C含量、高濃度Cur能顯著抑制血漿中TG、Glucose、TCH和NEFA含量,而對AST、ALT和AST/ALT無顯著影響。HE切片結(jié)果發(fā)現(xiàn),HFD+0.1%Cur、HFD-+0.5%Cur和HFD+1%Cur處理能顯著降低附睪脂肪組織和肝臟組織中脂滴的數(shù)目及附睪脂肪組織中脂肪細胞的體積,而對心臟、脾臟以及腎臟并無顯著病理變化。以上結(jié)果顯示,日糧中添加姜黃素能顯著抑制小鼠附睪脂肪沉積并降低血脂含量,對高脂日糧誘導的肥胖有較好的扭轉(zhuǎn)效果,此外,姜黃素可以顯著降低血糖含量,改善葡萄糖耐受。揭示姜黃素可以作為一種潛在調(diào)節(jié)劑,有效降低體脂沉積、血脂含量和血糖水平,增強葡萄糖耐受,從而為把姜黃素作為一種安全、有效的降脂、降糖飼料添加劑應(yīng)用于畜牧獸醫(yī)生產(chǎn)實踐提供有力的理論保障。
【學位授予單位】：揚州大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2019
【分類號】：S816.7
【圖文】：

圖１脂肪組織形成過程［４］逡逑Ｆｉｇｕｒｅ邋１邋Ｔｈｅ邋ｆｏｒｍａｔｉｏｎ邋ｏｆ邋ａｄｉｐｏｓｅ邋ｔｉｓｓｕｅ⑷逡逑在以往研宄中發(fā)現(xiàn)，許多細胞模型都可被用來研宄脂肪細胞的成脂分化過程，包括逡逑Ｃ３Ｈ／１０Ｔ１／２間充質(zhì)干細胞、ＯＰ９前體脂肪細胞和小鼠３Ｔ３－Ｌ１成纖維細胞［５＿７］。從以往的研逡逑[傊蟹⑾鄭∈螅常裕常蹋背上宋赴狄恢筆羌ㄖ舊傻鶻諞蜃雍橢鞠赴δ埽ㄈ玨義現(xiàn)舊傘⒅痙紙獾齲┑謀曜寄Ｐ拖低場Ｔ冢玻笆蘭停罰澳甏�，繚}澹澹詈退耐旅鞘紫儒義戲擲牖竦昧隋澹常裕常蹋斃∈笈嚀コ上宋赴郟福藎淙淮有翁峽錘孟赴敕侵駒猿上宋稿義

本文編號：2790581