【摘要】：近年來(lái),隨著人們對(duì)食品安全及生態(tài)環(huán)境的關(guān)注度不斷提高,抗生素殘留和細(xì)菌耐藥性等問(wèn)題也逐漸暴露出來(lái),抗生素的禁用將會(huì)是畜牧獸醫(yī)行業(yè)發(fā)展的必然趨勢(shì)。因此,尋求開發(fā)綠色、安全的替代抗生素的飼料添加劑刻不容緩。姜黃素(Curcumin,Cur)是從中藥姜黃中提取的一種酚類物質(zhì),作為一種多效的天然活性成分,姜黃素有希望取代抗生素,在畜禽“無(wú)抗養(yǎng)殖”中發(fā)揮重要作用。雖然長(zhǎng)期以來(lái)姜黃素作為一種常用的天然色素,已被廣泛地應(yīng)用在食品工業(yè)中,但其在畜牧獸醫(yī)生產(chǎn)中的應(yīng)用性研究相對(duì)較少,尤其是在減少畜禽脂肪沉積效果方面的研究更少。本研究以原代培養(yǎng)的豬前體脂肪細(xì)胞和小鼠3T3-L1前體脂肪細(xì)胞系為體外模型,探討姜黃素對(duì)脂肪細(xì)胞增殖和成脂分化的影響,并以高脂日糧誘導(dǎo)的C57BL/6J肥胖小鼠為體內(nèi)模型,深入探討姜黃素對(duì)小鼠脂肪沉積的調(diào)控作用及對(duì)高脂飲食誘導(dǎo)小鼠肥胖的抑制效果。研究結(jié)果將為姜黃素作為安全、有效的飼料添加劑在畜牧獸醫(yī)生產(chǎn)上的應(yīng)用提供科學(xué)依據(jù)。實(shí)驗(yàn)一、姜黃素對(duì)小鼠3T3-L1前體脂肪細(xì)胞增殖和成脂分化的作用研究將小鼠3T3-L1前體脂肪細(xì)胞進(jìn)行增殖培養(yǎng),待細(xì)胞達(dá)到80%-90%融合時(shí),利用含終濃度為 0.1 mmol/L3-異丁基-1-甲基黃嘌呤(IBMX),2.5 μμmol/L地塞米松(DEX),1 μg/mL胰島素(Insulin)和2 μmol/L羅格列酮的誘導(dǎo)分化液I對(duì)細(xì)胞進(jìn)行誘導(dǎo)分化,同時(shí)添加不同濃度姜黃素處理,共分為6組:①未誘導(dǎo)分化組(None,完全培養(yǎng)基);②誘導(dǎo)分化對(duì)照組(DM,誘導(dǎo)分化液+姜黃素溶解試劑DMSO);③誘導(dǎo)分化液+2.5 μμmol/L姜黃素組(DM+2.5μmol/LCur);④誘導(dǎo)分化液+5μmol/L 姜黃素組(DM+5μmol/LCur);⑤誘導(dǎo)分化液+10 μmol/L姜黃素組(DM+10 μmol/L Cur);⑥誘導(dǎo)分化液+15 μmol/L姜黃素組(DM+15 μmol/L Cur);3天后,更換只含有1 μg/mL Insulin的誘導(dǎo)分化液II進(jìn)行處理,2天換液一次,6天后(共處理9天)在顯微鏡下觀察細(xì)胞成脂分化情況,采用CCK法檢測(cè)細(xì)胞增殖活力,通過(guò)油紅O染色和甘油三酯(TG)定量試劑盒檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)TG含量,通過(guò)甘油含量測(cè)定試劑盒和小鼠游離脂肪酸(FFA)ELISA檢測(cè)試劑盒測(cè)定細(xì)胞上清中甘油和FFA的含量,通過(guò)以上指標(biāo)綜合評(píng)價(jià)姜黃素對(duì)小鼠3T3-L1前體脂肪細(xì)胞增殖和成脂分化的影響。此外,通過(guò)熒光定量PCR(q-PCR)法進(jìn)一步檢測(cè)姜黃素對(duì)3T3-L1細(xì)胞成脂分化相關(guān)基因表達(dá)的影響,初步闡明姜黃素影響3T3-L1細(xì)胞成脂分化的可能機(jī)制。研究結(jié)果顯示,與DM組相比,2.5、5、10、15 μmol/L姜黃素處理對(duì)細(xì)胞活力無(wú)顯著影響,而20 μmol/L姜黃素處理能顯著抑制細(xì)胞增殖活力。顯微鏡下觀察發(fā)現(xiàn),與DM組相比,2.5、5、10、15μmol/L姜黃素處理組細(xì)胞脂滴沉積量顯著降低,油紅O染色結(jié)果表明,與DM組相比,姜黃素處理組紅染陽(yáng)性細(xì)胞明顯減少,TG沉積量顯著下降,并且呈劑量依賴性抑制作用;此外,姜黃素處理組細(xì)胞上清中甘油和FFA釋放量也呈劑量依賴性抑制作用。以上結(jié)果表明,姜黃素處理能在一定程度上抑制3T3-L1前體脂肪細(xì)胞的增殖和成脂分化,呈劑量依賴性。q-PCR的結(jié)果顯示,姜黃素處理能顯著抑制脂肪細(xì)胞分化關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子C/EBP-α、PPAR-γ和C/EBP-β,脂肪合成標(biāo)志基因FAS、SCD和aP2的mRNA表達(dá),并顯著增加脂肪分解標(biāo)志基因ATGL mRNA表達(dá)。以上結(jié)果說(shuō)明姜黃素抑制3T3-L1細(xì)胞脂質(zhì)沉積,一方面與抑制成脂分化、減少脂肪合成有關(guān)外,另一方面還可能與脂肪分解的增強(qiáng)有關(guān)。實(shí)驗(yàn)二、姜黃素對(duì)豬前體脂肪細(xì)胞增殖和成脂分化的作用研究分離斷奶仔豬頸、背部皮下脂肪組織,采用Ⅰ型膠原酶分離前體脂肪細(xì)胞,細(xì)胞達(dá)到80%-90%融合時(shí),使用含終濃度為 0.1 mmol/LIBMX,2.5μμmol/LDEX,1μg/mLInsulin 和2 μmol/L羅格列酮的誘導(dǎo)分化液進(jìn)行成脂分化誘導(dǎo),并同時(shí)添加姜黃素處理,根據(jù)姜黃素濃度的不同,共分為5組:①誘導(dǎo)分化對(duì)照組(DM,誘導(dǎo)分化液+DMSO);②誘導(dǎo)分化液+2.5μmol/L姜黃素組(DM+2.5μmol/LCur);③誘導(dǎo)分化液+5 μmol/L姜黃素組(DM+5 μmol/L Cur);④誘導(dǎo)分化液+10 μmol/L姜黃素組(DM+10 μmol/L Cur);⑤誘導(dǎo)分化液+15 μmol/L姜黃素組(DM-+15 μmol/LCur);利用CCK法檢測(cè)細(xì)胞增殖活力,通過(guò)油紅O染色法檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)TG含量,采用q-PCR方法檢測(cè)脂肪細(xì)胞分化關(guān)鍵基因PPAR-γ和C/EBP-β、脂肪合成關(guān)鍵酶FAS和ACC以及脂肪分解限速酶HSL,ATGL和LPL的mRNA表達(dá)。應(yīng)用酶化學(xué)法測(cè)定細(xì)胞內(nèi)脂肪分解酶的酶活。CCK檢測(cè)結(jié)果顯示,與DM對(duì)照組細(xì)胞相比,2.5、5、10 μmol/L姜黃素處理48 h和72 h對(duì)原代培養(yǎng)的豬前體脂肪細(xì)胞增殖活力無(wú)顯著影響,但20 μmol/L姜黃素處理48 h和72 h均顯著抑制了細(xì)胞的增殖活力。油紅O染色結(jié)果表明,與DM組細(xì)胞相比,10μmol/L姜黃素處理48 h和72 h極顯著降低了細(xì)胞內(nèi)TG含量。顯微鏡下觀察也發(fā)現(xiàn),與DM對(duì)照組細(xì)胞相比,10 μmol/L姜黃素處理組細(xì)胞脂滴沉積量明顯減少,表明姜黃素對(duì)豬前體脂肪細(xì)胞的增殖和成脂分化也有一定的抑制作用,并且呈劑量、時(shí)間依賴性。q-PCR的結(jié)果表明,與DM組細(xì)胞相比,10μmol/L姜黃素處理能顯著降低脂肪分化成脂過(guò)程中兩個(gè)重要轉(zhuǎn)錄因子PPAR-γ和C/EBP-β的mRNA表達(dá),此外,脂肪合成過(guò)程中兩個(gè)重要的合成酶ACC和FAS的mRNA表達(dá)也顯著下降;另外,姜黃素處理能顯著升高脂肪分解限速酶HSL和ATGL的mRNA表達(dá)量和酶活。此外,10 μmol/L姜黃素處理能顯著增加自噬標(biāo)志基因LC3和溶酶體酸性脂肪酶LIPA的mRNA表達(dá),并能顯著增加LC3蛋白的表達(dá)及LC3II/LC3I的比值。以上結(jié)果表明,姜黃素抑制豬前體脂肪細(xì)胞的成脂分化可能與脂肪合成的抑制及脂肪分解的增強(qiáng)有關(guān),還可能跟自噬激活機(jī)制有關(guān)。實(shí)驗(yàn)三、日糧中添加姜黃素對(duì)高脂日糧誘導(dǎo)的C57BL/6J肥胖小鼠模型脂肪沉積的影響選取60只飼養(yǎng)環(huán)境、遺傳背景等相似的C57BL/6J雄性小鼠(4周齡,15-17 g),隨機(jī)均分成5組,分別飼喂標(biāo)準(zhǔn)日糧(Normaldiet,ND)、高脂日糧(Highfatdiet,HFD)、高脂日糧和0.1%姜黃素(HFD+0.1%Cur)、高脂日糧和0.5%姜黃素(HFD+0.5%Cur)及高脂日糧和1%姜黃素(HFD+1%Cur),飼喂12周。記錄每周體重(Body weight,BW)與采食量;在第4、8、12周分別進(jìn)行口服葡萄糖耐受試驗(yàn)(Oral glucose tolerance test,OGTT)并計(jì)算曲線下面積(AUC)。試驗(yàn)結(jié)束時(shí),記錄小鼠體重、附睪脂肪重量,并計(jì)算體重增長(zhǎng)量及附睪脂肪重量/體重比值,記錄肝臟、心臟、脾臟、腎臟、睪丸、腓腸肌及比目魚肌的重量并計(jì)算器官和體重比。檢測(cè)血漿中脂代謝相關(guān)生化指標(biāo)含量,并通過(guò)HE染色法檢測(cè)附睪脂肪和肝臟組織中脂滴沉積量,并對(duì)心臟、脾臟和腎臟組織樣等進(jìn)行病理學(xué)分析。研究結(jié)果顯示,與HFD組小鼠相比,HFD+Cur處理能顯著降低小鼠體重、小鼠體重增長(zhǎng)值、并能顯著抑制小鼠附睪脂肪組織重及附睪脂肪與體重比,并且呈劑量依賴性抑制作用。此外,HFD與HFD+Cur組小鼠的采食量和飼料利用率無(wú)顯著差異。相對(duì)器官重量統(tǒng)計(jì)結(jié)果顯示,與HFD組小鼠相比,HFD+Cur處理對(duì)肝臟、心臟、脾臟、腎臟、睪丸、腓腸肌、睪丸的重量并無(wú)顯著影響,但能顯著增加比目魚肌重量以及肝臟/體重和比目魚肌重/體重。OGTT實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,與HFD組小鼠相比,HFD+0.1%Cur、HFD+0.5%Cur和HFD+1%Cur處理能不同程度抑制血糖濃度,并顯著抑制AUC值,且呈劑量依賴性抑制作用。血液生化指標(biāo)顯示,低濃度Cur就能顯著抑制LDL-C含量、高濃度Cur能顯著抑制血漿中TG、Glucose、TCH和NEFA含量,而對(duì)AST、ALT和AST/ALT無(wú)顯著影響。HE切片結(jié)果發(fā)現(xiàn),HFD+0.1%Cur、HFD-+0.5%Cur和HFD+1%Cur處理能顯著降低附睪脂肪組織和肝臟組織中脂滴的數(shù)目及附睪脂肪組織中脂肪細(xì)胞的體積,而對(duì)心臟、脾臟以及腎臟并無(wú)顯著病理變化。以上結(jié)果顯示,日糧中添加姜黃素能顯著抑制小鼠附睪脂肪沉積并降低血脂含量,對(duì)高脂日糧誘導(dǎo)的肥胖有較好的扭轉(zhuǎn)效果,此外,姜黃素可以顯著降低血糖含量,改善葡萄糖耐受。揭示姜黃素可以作為一種潛在調(diào)節(jié)劑,有效降低體脂沉積、血脂含量和血糖水平,增強(qiáng)葡萄糖耐受,從而為把姜黃素作為一種安全、有效的降脂、降糖飼料添加劑應(yīng)用于畜牧獸醫(yī)生產(chǎn)實(shí)踐提供有力的理論保障。
【學(xué)位授予單位】：揚(yáng)州大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2019
【分類號(hào)】：S816.7
【圖文】：

圖１脂肪組織形成過(guò)程［４］逡逑Ｆｉｇｕｒｅ邋１邋Ｔｈｅ邋ｆｏｒｍａｔｉｏｎ邋ｏｆ邋ａｄｉｐｏｓｅ邋ｔｉｓｓｕｅ⑷逡逑在以往研宄中發(fā)現(xiàn)，許多細(xì)胞模型都可被用來(lái)研宄脂肪細(xì)胞的成脂分化過(guò)程，包括逡逑Ｃ３Ｈ／１０Ｔ１／２間充質(zhì)干細(xì)胞、ＯＰ９前體脂肪細(xì)胞和小鼠３Ｔ３－Ｌ１成纖維細(xì)胞［５＿７］。從以往的研逡逑[傊蟹⑾鄭∈螅常裕常蹋背上宋赴狄恢筆羌ㄖ舊傻鶻諞蜃雍橢鞠赴δ埽ㄈ玨義現(xiàn)舊傘⒅痙紙獾齲┑謀曜寄Ｐ拖低場(chǎng)Ｔ冢玻笆蘭停罰澳甏�，繚}澹澹詈退耐旅鞘紫儒義戲擲牖竦昧隋澹常裕常蹋斃∈笈嚀コ上宋赴郟福藎淙淮有翁峽錘孟赴敕侵駒猿上宋稿義

本文編號(hào)：2790581