【摘要】：在熱休克、饑餓、氧化應激、紫外線照射、缺氧或病毒感染等環(huán)境壓力下,真核細胞的翻譯被抑制,從而使mRNA(messenger RNA)和相關蛋白聚集形成一種無膜動態(tài)結構,這種結構被稱為應激顆粒(Stress granules,SGs)。應激顆粒的主要功能是存儲處于壓力條件下細胞的mRNA,并保護其不被降解。應激顆粒的組成成分非常復雜,在不同壓力條件下存在差異,且可能包含很多信號通路中的關鍵蛋白。因此,應激顆粒能參與多種信號通路的調控,進而影響很多疾病的發(fā)生及發(fā)展,例如腫瘤、神經退行性疾病、病毒感染等。G3BP1(RAS GTPase-activating protein SH3domain-binding protein 1)是應激顆粒的成核蛋白之一,也被證實是一種新型抗病毒因子,能夠拮抗多種病毒的增殖。豬繁殖與呼吸綜合征(Porcine reproductive and respiratory syndrome,PRRS)是目前影響全球養(yǎng)豬業(yè)發(fā)展的重要疾病之一。因此,本文針對豬繁殖與呼吸綜合征病毒(PRRSV)開展了其調控應激顆粒形成的分子機制研究,發(fā)現(xiàn)PRRSV通過激活PERK(PKR-like endoplasmic reticulum kinase)誘導經典應激顆粒的形成,且利用自身編碼的N蛋白上調G3BP1的磷酸化水平,進而逃避G3BP1的抗病毒作用。主要研究內容如下:1.PRRSV感染誘導經典應激顆粒的形成為了檢測PRRSV感染是否誘導應激顆粒的形成,首先以應激顆粒的關鍵成核蛋白TIA1(T cell-restricted intracellular antigen 1)和G3BP1作為標志蛋白,通過間接免疫熒光實驗檢測病毒感染后不同時間點TIA1和G3BP1的聚集情況。結果顯示,在病毒感染細胞中,TIA1和G3BP1均聚集成點狀顆粒分散于細胞質中,且TIA1與G3BP1在PRRSV感染細胞中存在共定位,提示PRRSV感染誘導應激顆粒的形成。為了檢測該顆粒是否是經典的應激顆粒,進一步檢測了經典應激顆粒的標志蛋白翻譯起始因子3η(eukaryotic initiation factor 3,eIF3η)在細胞中的定位。結果發(fā)現(xiàn),在感染后期,eIF3η與G3BP1之間存在共定位,說明PRRSV誘導經典應激顆粒的形成;然而紫外滅活的PRRSV不能誘導應激顆粒的形成,表明PRRSV誘導應激顆粒的形成依賴于其正常復制。2.PRRSV通過PERK誘導應激顆粒的形成為了進一步分析PRRSV誘導應激顆�？赡艿男盘柾�,通過Western blot實驗發(fā)現(xiàn),PRRSV感染上調eIF2α的磷酸化水平,推測PRRSV誘導應激顆粒形成依賴于eIF2α的磷酸化。eIF2α上游存在四種激酶,分別為PKR(protein kinase RNA-dependent kinase)、HRI(heme-regulated initiation factor 2αkinase)、GCN2(general control non-derepressible 2)及PERK。為了確定在PRRSV感染細胞中誘導eIF2α磷酸化的激酶,首先利用PKR特異性抑制劑C16及2-AP(2-aminopurine)處理細胞,發(fā)現(xiàn)C16及2-AP均不能抑制PRRSV誘導應激顆粒的形成;而用PERK抑制劑PERK-I(516535 PERK Inhibitor I,GSK2606414)處理細胞能顯著降低PRRSV誘導應激顆粒的數(shù)量;另外,考慮到沒有針對GCN2及HRI的特異性抑制劑,通過轉染GCN2和HRI相應的siRNAs,發(fā)現(xiàn)干擾GCN2和HRI均不影響PRRSV誘導應激顆粒的聚集。以上結果說明PRRSV誘導應激顆粒的形成不依賴于PKR、GCN2及HRI,而是通過PERK途徑。Western blot實驗結果顯示,只有PERK-I能抑制PRRSV上調的eIF2α磷酸化水平,而抑制PKR、干擾GCN2或HRI均對PRRSV誘導的eIF2α磷酸化水平無顯著影響,進一步證實PRRSV誘導應激顆粒的形成依賴于PERK。3.應激顆粒及其組成成分G3BP1輕微抑制PRRSV增殖以前的研究證實同時干擾TIA1、G3BP1及TIAR(TIA1-related protein)的表達能顯著抑制亞砷酸鈉誘導應激顆粒產生。為了探討應激顆粒形成對PRRSV增殖的影響,通過特異性siRNA同時干擾細胞的TIA1、TIAR及G3BP1,發(fā)現(xiàn)抑制應激顆粒形成只能輕微促進PRRSV增殖,但顯著上調PRRSV誘導炎癥因子的產生。應激顆粒的組成成分G3BP1被認為是一個新型抗病毒因子,但超表達或穩(wěn)定表達G3BP1均只能輕微抑制PRRSV增殖。以上結果表明,應激顆粒及其組成成分G3BP1僅能輕微抑制PRRSV增殖,提示PRRSV可能拮抗應激顆粒及G3BP1的抗病毒作用。4.PRRSV N蛋白上調G3BP1的磷酸化水平,從而逃避其抗病毒作用本實驗室前期通過PRRSV感染細胞的磷酸化蛋白質組學數(shù)據(jù)分析發(fā)現(xiàn),PRRSV能上調G3BP1的磷酸化水平,本研究通過Western blot實驗進一步證實了組學結果。為了檢測G3BP1磷酸化修飾對PRRSV感染的影響,將其149及231位絲氨酸(S)殘基突變?yōu)楸彼?A)或谷氨酸(E),分別模擬其去磷酸化(S149A/S231A)及磷酸化(S149E/S231E)狀態(tài)。結果發(fā)現(xiàn),S149A/S231A突變體抑制PRRSV增殖的能力較G3BP1野生型增強,而S149E/S231E突變體對PRRSV增殖無顯著影響,提示PRRSV可能通過上調G3BP1的磷酸化水平,逃避G3BP1的抗病毒作用,但PRRSV通過哪種編碼蛋白逃避G3BP1的抗病毒作用尚不清楚。從以前關于PRRSV N蛋白與宿主細胞蛋白相互作用組學的數(shù)據(jù)庫中發(fā)現(xiàn),N蛋白與G3BP1之間存在潛在的相互作用。本研究進一步通過Co-IP實驗證實,在PRRSV感染或者N蛋白超表達條件下,G3BP1與N蛋白存在相互作用,且發(fā)現(xiàn)PRRSV N蛋白顯著上調G3BP1的磷酸化水平。以上結果表明,PRRSV可能通過N蛋白上調G3BP1的磷酸化水平,從而拮抗G3BP1的抗病毒作用�？傊�,本研究對PRRSV感染細胞后的應激顆粒形成機制進行了研究,發(fā)現(xiàn)PRRSV感染細胞后應激顆粒標志蛋白TIA1、G3BP1、eIF3η在細胞質中聚集成點狀顆粒,且存在共定位,表明PRRSV誘導經典應激顆粒的形成;隨后發(fā)現(xiàn)PRRSV通過PERK上調eIF2α的磷酸化水平,誘導應激顆粒的形成;然而應激顆粒及其組成成分G3BP1僅能輕微抑制PRRSV增殖,進一步研究發(fā)現(xiàn)PRRSV能通過N蛋白上調G3BP1的磷酸化水平,從而拮抗G3BP1的抗病毒作用。
【學位授予單位】：華中農業(yè)大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2019
【分類號】：S852.651
【圖文】：

華中農業(yè)大學 2019 屆博士研究生學位論文initiation factor 2α kinase）(Anderson et al. 2008; Donnelly et al. 2013; McEwen et al.2005)；熱休克，病毒感染，紫外照射激活 PKR（protein kinase RNA-dependent kinase）(Anderson et al. 2008; Donnelly et al. 2013; White et al. 2012)；位于內質網的未折疊蛋白激活 PERK（PKR-like endoplasmic reticulum kinase）；氨基酸缺乏激活 GCN2（general control non-derepressible 2）(Anderson et al. 2008; Donnelly et al. 2013)。這四種激酶磷酸化 eIF2α 的 51 位絲氨酸，導致翻譯起始所必須的 eIF2/tRNAiMet/GTP三元復合物減少，不能形成有功能的 48S 復合物，而是產生大量無功能的非經典 48S復合物。該復合物不能招募 60S 核糖體亞基，因此不能參與翻譯，而是被招募進入應激顆粒，參與應激顆粒的組裝(Kedersha et al. 2002c; Kedersha et al. 2013; Thomaset al. 2011)。另外，當 eIF4A 和 eIF4G 的功能被拮抗時，也能抑制翻譯，從而誘導應激顆粒的形成，如 pateamine A 等藥物能通過破壞 eIF4A 進而誘導應激顆粒的形成(Low et al. 2005; Mazroui et al. 2006; Thomas et al. 2011)。

圖 1-2 病毒誘導應激顆粒的信號通路 (McCormick et al. 2017)Fig. 1-2 The signaling pathway involved in induction of stress granules by virus大多數(shù)病毒均需要利用宿主細胞的翻譯機制來合成病毒蛋白，因此，真核細胞進化出了各種機制來關閉翻譯，以抵抗病毒感染。當宿主細胞被病毒感染時，eIF2α發(fā)生磷酸化，導致翻譯起始被抑制，進而誘導應激顆粒形成。該途徑可以迅速破壞病毒蛋白的合成，從而在宿主抗病毒蛋白的轉錄上調之前就能在一定程度上拮抗病毒增殖，因此，應激顆粒的形成被認為是一種重要的天然免疫防御機制。大多數(shù)病毒能通過抑制 eIF2α 的磷酸化而拮抗應激顆粒的形成，最終逃避應激顆粒的抗病毒作用(Cheng et al. 2005; Garcia et al. 2007)，例如單純性皰疹病毒 1（Herpes Simplexvirus，HSV-1）的內切核糖核酸酶 VHS（virion host shutoff）抑制應激顆粒形成(Burgesset al. 2018)。此外，一些病毒利用內部核糖體進入位點（internal ribosome entry sites，IRES）起始翻譯，該機制不依賴于 eIF2α 的磷酸化途徑，所以當宿主翻譯關閉時，病毒仍能通過eIF2α非依賴的方式合成蛋白，最終逃避應激顆粒的抗病毒作用(Jan et

(Fang et al. 2012b; Li et al. 2014)。病毒基因組的 3’末端包含 8 個相對較小的基因，除了北美型 PRRSV 的 ORF4/ORF5，這些基因的 5’端和 3’端序列與鄰近基因均有重疊（圖 1-3），并編碼四種膜相關糖蛋白（GP2a、GP3、GP4 和 GP5）、三種未糖基化的膜蛋白（E、ORF5a 和 M）和一種核衣殼蛋白（N）(Snijder et al. 2013)。

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本文編號：2789121