【摘要】：在熱休克、饑餓、氧化應(yīng)激、紫外線照射、缺氧或病毒感染等環(huán)境壓力下,真核細(xì)胞的翻譯被抑制,從而使mRNA(messenger RNA)和相關(guān)蛋白聚集形成一種無膜動(dòng)態(tài)結(jié)構(gòu),這種結(jié)構(gòu)被稱為應(yīng)激顆粒(Stress granules,SGs)。應(yīng)激顆粒的主要功能是存儲處于壓力條件下細(xì)胞的mRNA,并保護(hù)其不被降解。應(yīng)激顆粒的組成成分非常復(fù)雜,在不同壓力條件下存在差異,且可能包含很多信號通路中的關(guān)鍵蛋白。因此,應(yīng)激顆粒能參與多種信號通路的調(diào)控,進(jìn)而影響很多疾病的發(fā)生及發(fā)展,例如腫瘤、神經(jīng)退行性疾病、病毒感染等。G3BP1(RAS GTPase-activating protein SH3domain-binding protein 1)是應(yīng)激顆粒的成核蛋白之一,也被證實(shí)是一種新型抗病毒因子,能夠拮抗多種病毒的增殖。豬繁殖與呼吸綜合征(Porcine reproductive and respiratory syndrome,PRRS)是目前影響全球養(yǎng)豬業(yè)發(fā)展的重要疾病之一。因此,本文針對豬繁殖與呼吸綜合征病毒(PRRSV)開展了其調(diào)控應(yīng)激顆粒形成的分子機(jī)制研究,發(fā)現(xiàn)PRRSV通過激活PERK(PKR-like endoplasmic reticulum kinase)誘導(dǎo)經(jīng)典應(yīng)激顆粒的形成,且利用自身編碼的N蛋白上調(diào)G3BP1的磷酸化水平,進(jìn)而逃避G3BP1的抗病毒作用。主要研究內(nèi)容如下:1.PRRSV感染誘導(dǎo)經(jīng)典應(yīng)激顆粒的形成為了檢測PRRSV感染是否誘導(dǎo)應(yīng)激顆粒的形成,首先以應(yīng)激顆粒的關(guān)鍵成核蛋白TIA1(T cell-restricted intracellular antigen 1)和G3BP1作為標(biāo)志蛋白,通過間接免疫熒光實(shí)驗(yàn)檢測病毒感染后不同時(shí)間點(diǎn)TIA1和G3BP1的聚集情況。結(jié)果顯示,在病毒感染細(xì)胞中,TIA1和G3BP1均聚集成點(diǎn)狀顆粒分散于細(xì)胞質(zhì)中,且TIA1與G3BP1在PRRSV感染細(xì)胞中存在共定位,提示PRRSV感染誘導(dǎo)應(yīng)激顆粒的形成。為了檢測該顆粒是否是經(jīng)典的應(yīng)激顆粒,進(jìn)一步檢測了經(jīng)典應(yīng)激顆粒的標(biāo)志蛋白翻譯起始因子3η(eukaryotic initiation factor 3,eIF3η)在細(xì)胞中的定位。結(jié)果發(fā)現(xiàn),在感染后期,eIF3η與G3BP1之間存在共定位,說明PRRSV誘導(dǎo)經(jīng)典應(yīng)激顆粒的形成;然而紫外滅活的PRRSV不能誘導(dǎo)應(yīng)激顆粒的形成,表明PRRSV誘導(dǎo)應(yīng)激顆粒的形成依賴于其正常復(fù)制。2.PRRSV通過PERK誘導(dǎo)應(yīng)激顆粒的形成為了進(jìn)一步分析PRRSV誘導(dǎo)應(yīng)激顆�？赡艿男盘柾�,通過Western blot實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn),PRRSV感染上調(diào)eIF2α的磷酸化水平,推測PRRSV誘導(dǎo)應(yīng)激顆粒形成依賴于eIF2α的磷酸化。eIF2α上游存在四種激酶,分別為PKR(protein kinase RNA-dependent kinase)、HRI(heme-regulated initiation factor 2αkinase)、GCN2(general control non-derepressible 2)及PERK。為了確定在PRRSV感染細(xì)胞中誘導(dǎo)eIF2α磷酸化的激酶,首先利用PKR特異性抑制劑C16及2-AP(2-aminopurine)處理細(xì)胞,發(fā)現(xiàn)C16及2-AP均不能抑制PRRSV誘導(dǎo)應(yīng)激顆粒的形成;而用PERK抑制劑PERK-I(516535 PERK Inhibitor I,GSK2606414)處理細(xì)胞能顯著降低PRRSV誘導(dǎo)應(yīng)激顆粒的數(shù)量;另外,考慮到?jīng)]有針對GCN2及HRI的特異性抑制劑,通過轉(zhuǎn)染GCN2和HRI相應(yīng)的siRNAs,發(fā)現(xiàn)干擾GCN2和HRI均不影響PRRSV誘導(dǎo)應(yīng)激顆粒的聚集。以上結(jié)果說明PRRSV誘導(dǎo)應(yīng)激顆粒的形成不依賴于PKR、GCN2及HRI,而是通過PERK途徑。Western blot實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,只有PERK-I能抑制PRRSV上調(diào)的eIF2α磷酸化水平,而抑制PKR、干擾GCN2或HRI均對PRRSV誘導(dǎo)的eIF2α磷酸化水平無顯著影響,進(jìn)一步證實(shí)PRRSV誘導(dǎo)應(yīng)激顆粒的形成依賴于PERK。3.應(yīng)激顆粒及其組成成分G3BP1輕微抑制PRRSV增殖以前的研究證實(shí)同時(shí)干擾TIA1、G3BP1及TIAR(TIA1-related protein)的表達(dá)能顯著抑制亞砷酸鈉誘導(dǎo)應(yīng)激顆粒產(chǎn)生。為了探討應(yīng)激顆粒形成對PRRSV增殖的影響,通過特異性siRNA同時(shí)干擾細(xì)胞的TIA1、TIAR及G3BP1,發(fā)現(xiàn)抑制應(yīng)激顆粒形成只能輕微促進(jìn)PRRSV增殖,但顯著上調(diào)PRRSV誘導(dǎo)炎癥因子的產(chǎn)生。應(yīng)激顆粒的組成成分G3BP1被認(rèn)為是一個(gè)新型抗病毒因子,但超表達(dá)或穩(wěn)定表達(dá)G3BP1均只能輕微抑制PRRSV增殖。以上結(jié)果表明,應(yīng)激顆粒及其組成成分G3BP1僅能輕微抑制PRRSV增殖,提示PRRSV可能拮抗應(yīng)激顆粒及G3BP1的抗病毒作用。4.PRRSV N蛋白上調(diào)G3BP1的磷酸化水平,從而逃避其抗病毒作用本實(shí)驗(yàn)室前期通過PRRSV感染細(xì)胞的磷酸化蛋白質(zhì)組學(xué)數(shù)據(jù)分析發(fā)現(xiàn),PRRSV能上調(diào)G3BP1的磷酸化水平,本研究通過Western blot實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步證實(shí)了組學(xué)結(jié)果。為了檢測G3BP1磷酸化修飾對PRRSV感染的影響,將其149及231位絲氨酸(S)殘基突變?yōu)楸彼?A)或谷氨酸(E),分別模擬其去磷酸化(S149A/S231A)及磷酸化(S149E/S231E)狀態(tài)。結(jié)果發(fā)現(xiàn),S149A/S231A突變體抑制PRRSV增殖的能力較G3BP1野生型增強(qiáng),而S149E/S231E突變體對PRRSV增殖無顯著影響,提示PRRSV可能通過上調(diào)G3BP1的磷酸化水平,逃避G3BP1的抗病毒作用,但PRRSV通過哪種編碼蛋白逃避G3BP1的抗病毒作用尚不清楚。從以前關(guān)于PRRSV N蛋白與宿主細(xì)胞蛋白相互作用組學(xué)的數(shù)據(jù)庫中發(fā)現(xiàn),N蛋白與G3BP1之間存在潛在的相互作用。本研究進(jìn)一步通過Co-IP實(shí)驗(yàn)證實(shí),在PRRSV感染或者N蛋白超表達(dá)條件下,G3BP1與N蛋白存在相互作用,且發(fā)現(xiàn)PRRSV N蛋白顯著上調(diào)G3BP1的磷酸化水平。以上結(jié)果表明,PRRSV可能通過N蛋白上調(diào)G3BP1的磷酸化水平,從而拮抗G3BP1的抗病毒作用�？傊�,本研究對PRRSV感染細(xì)胞后的應(yīng)激顆粒形成機(jī)制進(jìn)行了研究,發(fā)現(xiàn)PRRSV感染細(xì)胞后應(yīng)激顆粒標(biāo)志蛋白TIA1、G3BP1、eIF3η在細(xì)胞質(zhì)中聚集成點(diǎn)狀顆粒,且存在共定位,表明PRRSV誘導(dǎo)經(jīng)典應(yīng)激顆粒的形成;隨后發(fā)現(xiàn)PRRSV通過PERK上調(diào)eIF2α的磷酸化水平,誘導(dǎo)應(yīng)激顆粒的形成;然而應(yīng)激顆粒及其組成成分G3BP1僅能輕微抑制PRRSV增殖,進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)PRRSV能通過N蛋白上調(diào)G3BP1的磷酸化水平,從而拮抗G3BP1的抗病毒作用。
【學(xué)位授予單位】：華中農(nóng)業(yè)大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2019
【分類號】：S852.651
【圖文】：

華中農(nóng)業(yè)大學(xué) 2019 屆博士研究生學(xué)位論文initiation factor 2α kinase）(Anderson et al. 2008; Donnelly et al. 2013; McEwen et al.2005)；熱休克，病毒感染，紫外照射激活 PKR（protein kinase RNA-dependent kinase）(Anderson et al. 2008; Donnelly et al. 2013; White et al. 2012)；位于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的未折疊蛋白激活 PERK（PKR-like endoplasmic reticulum kinase）；氨基酸缺乏激活 GCN2（general control non-derepressible 2）(Anderson et al. 2008; Donnelly et al. 2013)。這四種激酶磷酸化 eIF2α 的 51 位絲氨酸，導(dǎo)致翻譯起始所必須的 eIF2/tRNAiMet/GTP三元復(fù)合物減少，不能形成有功能的 48S 復(fù)合物，而是產(chǎn)生大量無功能的非經(jīng)典 48S復(fù)合物。該復(fù)合物不能招募 60S 核糖體亞基，因此不能參與翻譯，而是被招募進(jìn)入應(yīng)激顆粒，參與應(yīng)激顆粒的組裝(Kedersha et al. 2002c; Kedersha et al. 2013; Thomaset al. 2011)。另外，當(dāng) eIF4A 和 eIF4G 的功能被拮抗時(shí)，也能抑制翻譯，從而誘導(dǎo)應(yīng)激顆粒的形成，如 pateamine A 等藥物能通過破壞 eIF4A 進(jìn)而誘導(dǎo)應(yīng)激顆粒的形成(Low et al. 2005; Mazroui et al. 2006; Thomas et al. 2011)。

圖 1-2 病毒誘導(dǎo)應(yīng)激顆粒的信號通路 (McCormick et al. 2017)Fig. 1-2 The signaling pathway involved in induction of stress granules by virus大多數(shù)病毒均需要利用宿主細(xì)胞的翻譯機(jī)制來合成病毒蛋白，因此，真核細(xì)胞進(jìn)化出了各種機(jī)制來關(guān)閉翻譯，以抵抗病毒感染。當(dāng)宿主細(xì)胞被病毒感染時(shí)，eIF2α發(fā)生磷酸化，導(dǎo)致翻譯起始被抑制，進(jìn)而誘導(dǎo)應(yīng)激顆粒形成。該途徑可以迅速破壞病毒蛋白的合成，從而在宿主抗病毒蛋白的轉(zhuǎn)錄上調(diào)之前就能在一定程度上拮抗病毒增殖，因此，應(yīng)激顆粒的形成被認(rèn)為是一種重要的天然免疫防御機(jī)制。大多數(shù)病毒能通過抑制 eIF2α 的磷酸化而拮抗應(yīng)激顆粒的形成，最終逃避應(yīng)激顆粒的抗病毒作用(Cheng et al. 2005; Garcia et al. 2007)，例如單純性皰疹病毒 1（Herpes Simplexvirus，HSV-1）的內(nèi)切核糖核酸酶 VHS（virion host shutoff）抑制應(yīng)激顆粒形成(Burgesset al. 2018)。此外，一些病毒利用內(nèi)部核糖體進(jìn)入位點(diǎn)（internal ribosome entry sites，IRES）起始翻譯，該機(jī)制不依賴于 eIF2α 的磷酸化途徑，所以當(dāng)宿主翻譯關(guān)閉時(shí)，病毒仍能通過eIF2α非依賴的方式合成蛋白，最終逃避應(yīng)激顆粒的抗病毒作用(Jan et

(Fang et al. 2012b; Li et al. 2014)。病毒基因組的 3’末端包含 8 個(gè)相對較小的基因，除了北美型 PRRSV 的 ORF4/ORF5，這些基因的 5’端和 3’端序列與鄰近基因均有重疊（圖 1-3），并編碼四種膜相關(guān)糖蛋白（GP2a、GP3、GP4 和 GP5）、三種未糖基化的膜蛋白（E、ORF5a 和 M）和一種核衣殼蛋白（N）(Snijder et al. 2013)。

【相似文獻(xiàn)】

相關(guān)期刊論文 前10條

1 古洪盈;水霧化法制取鐵粉[J];鞍鋼技術(shù);1989年02期

2 ;蛛膜顆粒形成的磁共振[J];廣東解剖學(xué)通報(bào);1990年01期

3 鐘德鈺,王光謙,王士強(qiáng);非均勻顆粒形成漿體屈服應(yīng)力的計(jì)算模型[J];泥沙研究;1998年03期

4 齊淑玲;急性粒細(xì)胞白血病中的顆粒形成異常[J];國外醫(yī)學(xué)參考資料.輸血及血液學(xué)分冊;1978年01期

5 趙勁松;懸浮法聚氯乙烯顆粒形成的研究[J];高分子通訊;1981年04期

6 楊義濤;;注Ar尖晶石中空位型缺陷增強(qiáng)的Ag納米顆粒形成核研究(英文)[J];IMP & HIRFL Annual Report;2010年00期

7 馮帆;王莉莉;;基于ERα-EGFP核顆粒形成的熒光成像分析快速識別環(huán)境中雌激素樣物質(zhì)[J];軍事醫(yī)學(xué);2015年01期

8 Lindquist ME;;呼吸道合胞病毒誘導(dǎo)宿主細(xì)胞RNA應(yīng)激顆粒形成而促進(jìn)病毒復(fù)制[J];微生物與感染;2010年04期

9 遲凌云;;水邊的房子(五首)[J];詩林;2005年01期

10 ;無團(tuán)聚納米級二氧化鈦制備技術(shù)項(xiàng)目(專利申請?zhí)?200410014475.2)[J];中國粉體工業(yè);2007年01期

相關(guān)會議論文 前2條

1 高翔;;粉末中硬顆粒對陶瓷UO_2芯塊質(zhì)量的影響[A];中國核科學(xué)技術(shù)進(jìn)展報(bào)告（第二卷）——中國核學(xué)會2011年學(xué)術(shù)年會論文集第3冊（核能動(dòng)力分卷（下））[C];2011年

2 程鵬麗;胡瑞琴;陳良標(biāo);;低溫脅迫對斑馬魚成纖維細(xì)胞(ZF4)的應(yīng)激顆粒形成的影響[A];2018年中國水產(chǎn)學(xué)會學(xué)術(shù)年會論文摘要集[C];2018年

相關(guān)博士學(xué)位論文 前6條

1 任振興;左旋樟腦通過miR-140-HnrnpA1軸促進(jìn)急性腦缺血應(yīng)激顆粒形成的機(jī)制機(jī)制研究[D];廣州中醫(yī)藥大學(xué);2018年

2 周艷榮;PRRSV誘導(dǎo)應(yīng)激顆粒形成的機(jī)制研究[D];華中農(nóng)業(yè)大學(xué);2019年

3 史艷萍;生物素化普魯蘭多糖衍生物作為納米藥物載體的研究[D];中國協(xié)和醫(yī)科大學(xué);2007年

4 楊曉雪;釀酒酵母中應(yīng)激顆粒形成的相關(guān)基因及作用規(guī)律[D];哈爾濱工業(yè)大學(xué);2015年

5 孫英杰;新城疫病毒誘導(dǎo)宿主細(xì)胞應(yīng)激顆粒形成機(jī)制的研究[D];中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院;2015年

6 蔡開妹;PRV誘導(dǎo)IL-10及抑制應(yīng)激顆粒形成的機(jī)制研究[D];華中農(nóng)業(yè)大學(xué);2016年

相關(guān)碩士學(xué)位論文 前7條

1 尹秀娟;低溫脅迫下極地魚抗凍基因ld4對細(xì)胞應(yīng)激顆粒形成的影響[D];上海海洋大學(xué);2016年

2 楊文棟;Tudor-SN蛋白磷酸化對其參與應(yīng)激顆粒形成的機(jī)制研究[D];天津醫(yī)科大學(xué);2016年

3 王曉旭;新城疫病毒誘導(dǎo)宿主細(xì)胞應(yīng)激顆粒形成機(jī)制的初步探究[D];安徽農(nóng)業(yè)大學(xué);2014年

4 張頻;雞TIA-1和G3BP1在應(yīng)激顆粒形成和抗病毒反應(yīng)過程中的作用[D];山東農(nóng)業(yè)大學(xué);2017年

5 張健;EGR對生物柴油燃燒及碳煙顆粒形成的影響研究[D];江蘇大學(xué);2016年

6 俞軍;玻璃材料中銅納米顆粒形成研究[D];浙江工業(yè)大學(xué);2007年

7 李星;聚合氯化鋁投加時(shí)期對好氧顆粒污泥形成的影響[D];西安建筑科技大學(xué);2015年

本文編號：2789121