【摘要】：AP1M1基因(adaptor related protein complex 1 mu 1 subunit)編碼銜接蛋白復(fù)合體AP-1A的μ1A亞基,屬于銜接蛋白家族成員,在細(xì)胞內(nèi)貨物蛋白分選信號(hào)的識(shí)別機(jī)制上發(fā)揮著重要作用,參與了胞吐作用中分泌泡的形成、細(xì)胞膜上受體的循環(huán)等機(jī)體多種重要生理功能。睪丸作為機(jī)體重要的生殖器官,不僅是精子生成的場(chǎng)所,也是重要的內(nèi)分泌器官。AP1M1影響小鼠和人的睪丸發(fā)育,可能參與雄性動(dòng)物的繁殖。目前,有關(guān)AP1M1影響睪丸發(fā)育機(jī)制的研究報(bào)道還比較少,有待進(jìn)一步的證據(jù)支持。本研究以大足黑山羊?yàn)檠芯縿?dòng)物,首次成功克隆了山羊AP1M1基因的編碼序列,并在此基礎(chǔ)上,制作了山羊AP1M1分子的多克隆抗體,之后檢測(cè)了AP1M1的在成年大足黑山羊各組織及睪丸組織不同發(fā)育時(shí)期的表達(dá)量。相關(guān)研究結(jié)果如下:1、克隆了山羊AP1M1基因鑒于目前尚無山羊AP1M1基因序列報(bào)道,通過設(shè)計(jì)兩對(duì)特異性引物,經(jīng)序列拼接,首次成功克隆得到了山羊AP1M1基因序列(GenBank登錄號(hào):MH155258),其cDNA序列全長(zhǎng)1 661 bp,開放閱讀框?yàn)? 272 bp,編碼423個(gè)氨基酸,預(yù)測(cè)分子量48.59 KD;序列分析表明該基因在進(jìn)化上高度保守;含有5個(gè)蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)結(jié)合位點(diǎn),不含蛋白質(zhì)-核酸結(jié)合位點(diǎn);有19個(gè)磷酸化位點(diǎn),這些磷酸化位點(diǎn)可能對(duì)于AP1M1識(shí)別基于酪氨酸的分選信號(hào)“YXXΦ”起著重要作用;不含跨膜區(qū),信號(hào)肽結(jié)構(gòu);含有一個(gè)網(wǎng)格蛋白銜接蛋白蛋白復(fù)合體小鏈(Clathrin adaptor complex small chain,Clat-adaptor)結(jié)構(gòu)域和一個(gè)Adap-comp結(jié)構(gòu)域。2、制備了山羊AP1M1分子的多克隆抗體為了對(duì)AP1M1的功能進(jìn)行深入研究,構(gòu)建了pET30a(+)-his-AP1M1原核表達(dá)載體。對(duì)誘導(dǎo)表達(dá)條件進(jìn)行篩選,表明在0.2 mM IPTG,16℃,誘導(dǎo)20 h條件下誘導(dǎo)效果較好;重組蛋白主要以包涵體形式存在;對(duì)包涵體進(jìn)行處理,結(jié)果表明包涵體經(jīng)4 M尿素洗滌30 min,8 M尿素溶解,300 mM咪唑鎳柱洗脫,可獲得SDS-PAGE條帶單一的目標(biāo)蛋白;動(dòng)物免疫后獲得的抗血清經(jīng)Western blotting和間接Elisa檢測(cè),表明成功獲得了兔抗山羊的AP1M1多克隆抗體。3、分析了AP1M1在成年山羊不同組織以及睪丸發(fā)育各時(shí)期中的表達(dá)模式采用Q-PCR及Western blotting技術(shù)對(duì)AP1M1在山羊組織中的表達(dá)模式進(jìn)行分析,結(jié)果表明AP1M1在各組織的轉(zhuǎn)錄水平和蛋白水平表達(dá)模式一致,其中在睪丸中表達(dá)量較高,且隨著睪丸的發(fā)育,表達(dá)量有逐漸升高的趨勢(shì),體成熟時(shí)期達(dá)到最高,預(yù)示AP1M1與睪丸發(fā)育有關(guān),可能參與了雄性動(dòng)物的繁殖。本實(shí)驗(yàn)為進(jìn)一步研究AP1M1分子的功能提供了理論基礎(chǔ),也為研究AP1M1在睪丸發(fā)育過程中的功能奠定了基礎(chǔ)
【學(xué)位授予單位】：西南大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2018
【分類號(hào)】：S827
【圖文】：

AP）家族成員。蛋白質(zhì)通過細(xì)胞質(zhì)膜進(jìn)出細(xì)胞是一個(gè)復(fù)雜的過程，銜接蛋白 AP 復(fù)合物作為結(jié)合網(wǎng)格蛋白和貨物蛋白的“橋梁”，在囊泡外被形成及蛋白分選信號(hào)識(shí)別上起著重要作用[1-3]。1.1 銜接蛋白 AP1M1 概述1.1.1 銜接蛋白 AP 家族銜接蛋白 AP 是一類既能結(jié)合網(wǎng)格蛋白，又能與膜上受體結(jié)合的蛋白質(zhì)，在物質(zhì)的轉(zhuǎn)運(yùn)方面發(fā)揮著重要的作用，也稱橋接蛋白，在進(jìn)化上高度保守[2, 4-8]。AP 復(fù)合體是由兩個(gè)大亞基（ 、β、γ、δ、ε 或 ζ），一個(gè)中等亞基（μ1、μ2、μ3、μ4 和 μ5)，一個(gè)小亞基鏈（σ1、σ2、σ3、σ4 和 σ5）構(gòu)成的異源四聚體復(fù)合體（圖 1.1）。在小鼠中，大亞基約為 100KD，中等亞基約 50KD，小亞基約 17KD[1, 9]。目前在哺乳動(dòng)物中已經(jīng)確定了 7 種類型的 AP 復(fù)合體，分別為 AP-1A、AP-1B、AP-2、AP-3A、AP-3B、AP4 和 AP-5（圖 1.1），其中 AP-1A、AP-2、AP-3B、AP4 和 AP-5 廣泛表達(dá)，而 AP-1A、AP-3B 則具有組織特異性[1]。除 AP 復(fù)合物外，還存在其他種類的銜接蛋白如 GGA（Golgi-localized，γ-ear-containing，Arf-bindingprotein）[10-12]。

西南大學(xué)碩士學(xué)位論文胞漿和腔內(nèi)結(jié)構(gòu)域信號(hào)[28-31]。Mathilde 發(fā)現(xiàn)，在促腎上腺皮tropetumorcells）中降低 AP1M1 的表達(dá)后，TGN 潴泡和非成，表明 AP1M1 對(duì)于分泌泡的形成起著重要的作用[32]。M1 在免疫系統(tǒng)中的作用1 參與了免疫系統(tǒng)中 CD4 分子受體再循環(huán)過程[33]。分子（cluster of differentiation 4，分化抗原 4）是一種主要存 I 型跨膜糖蛋白分子，在 T 細(xì)胞中，它與 T 細(xì)胞抗原受體（Tce作用于識(shí)別抗原提呈細(xì)胞（antigen presenting cell，APC）上體 II（major histocompatibility complex II，MHC-II）分子呈peptide）[33]（圖 1.3）。

實(shí)驗(yàn)技術(shù)路線

【參考文獻(xiàn)】

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本文編號(hào)：2788818