【摘要】：AP1M1基因(adaptor related protein complex 1 mu 1 subunit)編碼銜接蛋白復(fù)合體AP-1A的μ1A亞基,屬于銜接蛋白家族成員,在細胞內(nèi)貨物蛋白分選信號的識別機制上發(fā)揮著重要作用,參與了胞吐作用中分泌泡的形成、細胞膜上受體的循環(huán)等機體多種重要生理功能。睪丸作為機體重要的生殖器官,不僅是精子生成的場所,也是重要的內(nèi)分泌器官。AP1M1影響小鼠和人的睪丸發(fā)育,可能參與雄性動物的繁殖。目前,有關(guān)AP1M1影響睪丸發(fā)育機制的研究報道還比較少,有待進一步的證據(jù)支持。本研究以大足黑山羊為研究動物,首次成功克隆了山羊AP1M1基因的編碼序列,并在此基礎(chǔ)上,制作了山羊AP1M1分子的多克隆抗體,之后檢測了AP1M1的在成年大足黑山羊各組織及睪丸組織不同發(fā)育時期的表達量。相關(guān)研究結(jié)果如下:1、克隆了山羊AP1M1基因鑒于目前尚無山羊AP1M1基因序列報道,通過設(shè)計兩對特異性引物,經(jīng)序列拼接,首次成功克隆得到了山羊AP1M1基因序列(GenBank登錄號:MH155258),其cDNA序列全長1 661 bp,開放閱讀框為1 272 bp,編碼423個氨基酸,預(yù)測分子量48.59 KD;序列分析表明該基因在進化上高度保守;含有5個蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)結(jié)合位點,不含蛋白質(zhì)-核酸結(jié)合位點;有19個磷酸化位點,這些磷酸化位點可能對于AP1M1識別基于酪氨酸的分選信號“YXXΦ”起著重要作用;不含跨膜區(qū),信號肽結(jié)構(gòu);含有一個網(wǎng)格蛋白銜接蛋白蛋白復(fù)合體小鏈(Clathrin adaptor complex small chain,Clat-adaptor)結(jié)構(gòu)域和一個Adap-comp結(jié)構(gòu)域。2、制備了山羊AP1M1分子的多克隆抗體為了對AP1M1的功能進行深入研究,構(gòu)建了pET30a(+)-his-AP1M1原核表達載體。對誘導表達條件進行篩選,表明在0.2 mM IPTG,16℃,誘導20 h條件下誘導效果較好;重組蛋白主要以包涵體形式存在;對包涵體進行處理,結(jié)果表明包涵體經(jīng)4 M尿素洗滌30 min,8 M尿素溶解,300 mM咪唑鎳柱洗脫,可獲得SDS-PAGE條帶單一的目標蛋白;動物免疫后獲得的抗血清經(jīng)Western blotting和間接Elisa檢測,表明成功獲得了兔抗山羊的AP1M1多克隆抗體。3、分析了AP1M1在成年山羊不同組織以及睪丸發(fā)育各時期中的表達模式采用Q-PCR及Western blotting技術(shù)對AP1M1在山羊組織中的表達模式進行分析,結(jié)果表明AP1M1在各組織的轉(zhuǎn)錄水平和蛋白水平表達模式一致,其中在睪丸中表達量較高,且隨著睪丸的發(fā)育,表達量有逐漸升高的趨勢,體成熟時期達到最高,預(yù)示AP1M1與睪丸發(fā)育有關(guān),可能參與了雄性動物的繁殖。本實驗為進一步研究AP1M1分子的功能提供了理論基礎(chǔ),也為研究AP1M1在睪丸發(fā)育過程中的功能奠定了基礎(chǔ)
【學位授予單位】：西南大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2018
【分類號】：S827
【圖文】：

AP）家族成員。蛋白質(zhì)通過細胞質(zhì)膜進出細胞是一個復(fù)雜的過程，銜接蛋白 AP 復(fù)合物作為結(jié)合網(wǎng)格蛋白和貨物蛋白的“橋梁”，在囊泡外被形成及蛋白分選信號識別上起著重要作用[1-3]。1.1 銜接蛋白 AP1M1 概述1.1.1 銜接蛋白 AP 家族銜接蛋白 AP 是一類既能結(jié)合網(wǎng)格蛋白，又能與膜上受體結(jié)合的蛋白質(zhì)，在物質(zhì)的轉(zhuǎn)運方面發(fā)揮著重要的作用，也稱橋接蛋白，在進化上高度保守[2, 4-8]。AP 復(fù)合體是由兩個大亞基（ 、β、γ、δ、ε 或 ζ），一個中等亞基（μ1、μ2、μ3、μ4 和 μ5)，一個小亞基鏈（σ1、σ2、σ3、σ4 和 σ5）構(gòu)成的異源四聚體復(fù)合體（圖 1.1）。在小鼠中，大亞基約為 100KD，中等亞基約 50KD，小亞基約 17KD[1, 9]。目前在哺乳動物中已經(jīng)確定了 7 種類型的 AP 復(fù)合體，分別為 AP-1A、AP-1B、AP-2、AP-3A、AP-3B、AP4 和 AP-5（圖 1.1），其中 AP-1A、AP-2、AP-3B、AP4 和 AP-5 廣泛表達，而 AP-1A、AP-3B 則具有組織特異性[1]。除 AP 復(fù)合物外，還存在其他種類的銜接蛋白如 GGA（Golgi-localized，γ-ear-containing，Arf-bindingprotein）[10-12]。

西南大學碩士學位論文胞漿和腔內(nèi)結(jié)構(gòu)域信號[28-31]。Mathilde 發(fā)現(xiàn)，在促腎上腺皮tropetumorcells）中降低 AP1M1 的表達后，TGN 潴泡和非成，表明 AP1M1 對于分泌泡的形成起著重要的作用[32]。M1 在免疫系統(tǒng)中的作用1 參與了免疫系統(tǒng)中 CD4 分子受體再循環(huán)過程[33]。分子（cluster of differentiation 4，分化抗原 4）是一種主要存 I 型跨膜糖蛋白分子，在 T 細胞中，它與 T 細胞抗原受體（Tce作用于識別抗原提呈細胞（antigen presenting cell，APC）上體 II（major histocompatibility complex II，MHC-II）分子呈peptide）[33]（圖 1.3）。

實驗技術(shù)路線

【參考文獻】

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本文編號：2788818