【摘要】：奶牛乳房炎不僅對奶牛業(yè)危害十分嚴重,而且也是導致奶牛淘汰的疾病之一。其中凝固酶陰性葡萄球菌如木糖葡萄球菌(Staphylococcus xylosus,S.xylosus)引起的感染呈上升趨勢,阻礙奶牛行業(yè)的未來發(fā)展。雖然凝固酶陰性葡萄球菌在傳統(tǒng)觀念上被定義為低致病性病原菌,但最近幾年,全球很多地區(qū)凝固酶陰性葡萄球菌造成奶牛乳房炎的數(shù)量不斷上升,而且木糖葡萄球菌能形成成熟的生物被膜(biofilm,BF),并且BF可以互相黏附或者黏附到生物活性或非活性物體表面,使生物被膜內細菌產生免疫逃避和耐藥性,導致奶牛乳房炎的感染遷延不愈。因此,對木糖葡萄球菌生物被膜調控機制的研究,尋找新型藥物作用靶標,提高奶牛乳房炎的預防和治療效果,已成為國內外科研工作者關注的焦點之一。阿司匹林(Aspirin)別名乙酰水楊酸,是非甾體抗炎類藥物,除具有退燒、解熱和抗炎作用外,也能干預白色念珠菌、表皮葡萄球菌、大腸桿菌和銅綠假單胞菌生物被膜的形成,但關于阿司匹林對木糖葡萄球菌生物被膜形成的干預作用尚未見報道。故本研究擬通過iTRAQ技術,在1/2 MIC阿司匹林作用下篩選木糖葡萄球菌生物被膜形成的差異表達蛋白,為確定阿司匹林的作用靶標提供理論支持。在分析差異表達蛋白的基礎上,進一步研究咪唑甘油磷酸酯脫水酶是否為阿司匹林的作用靶標。具體研究結果如下:(1)利用微量稀釋法測定阿司匹林對木糖葡萄球菌最小抑菌濃度(MIC)為1.25 mg/mL;基于結晶紫染色和掃描電子顯微鏡的方法,揭示亞抑菌濃度的阿司匹林對生物被膜的干預作用,結果表明,1/2 MIC(0.625 mg/mL)、1/4 MIC(0.3125 mg/mL)、1/8 MIC(0.15625 mg/mL)和1/16 MIC(0.078125 mg/mL)的阿司匹林均能顯著抑制木糖葡萄球菌生物被膜形成,并且破壞生物被膜的立體結構。(2)基于蛋白質組學TRAQ技術,對1/2 MIC(0.625 mg/mL)阿司匹林干預木糖葡萄球菌生物被膜差異表達蛋白質進行定量分析,揭示阿司匹林可能的作用靶標。根據比值1.2or0.8(p-value0.05)的差異蛋白選擇標準,共有178個差異表達蛋白被篩選并鑒定,其中67個(37.6%)蛋白上調表達,111個(62.4%)蛋白下調表達。在上述蛋白中,經過數(shù)據分析得到可能與生物被膜形成相關及在細菌代謝過程中發(fā)揮重要作用的蛋白,包括:咪唑甘油磷酸酯脫水酶(IGPD,A0A068E9J3)、組氨酸氨酶(huth,A0A060MSD4)、咪唑酮丙酸酶(hutI,A0A068E2P9)、尿刊酸水合酶(hutu,A0A068E633)、谷氨酰胺合成酶(GlnA,A0A068E8L1)、3-磷酸甘油醛脫氫酶(GAPDH,A0A060MH08)、磷酸谷胱甘肽酶(PGM,C6ZDJ7)、酮基酸還原異構酶(KARI,A0A068E468)、3-異丙基蘋果酸脫氫酶(LeuB,A0A068E3H6)和異檸檬酸脫氫酶(IDH,A0A090K7P3)。通過GO分析表明,大多數(shù)差異表達蛋白主要富集在代謝過程中。KEGG通路數(shù)據庫分析發(fā)現(xiàn)大量的差異表達蛋白涉及氨基酸合成、碳代謝(磷酸戊糖和糖酵解途徑,三羧酸循環(huán))和氮代謝(組氨酸代謝)等途徑,所以這些重要蛋白可能是阿司匹林干預木糖葡萄球菌生物被膜形成的候選靶標。在上述差異蛋白中,咪唑甘油磷酸酯脫水酶參與氮代謝中的組氨酸生物合成,而組氨酸對生物被膜的形成有顯著影響。所以本研究推測咪唑甘油磷酸酯脫水酶可能是阿司匹林的作用靶標,但是通過BIAcore分子互作試驗,結果表明阿司匹林與IGPD在體外沒有相互作用。綜上所述,阿司匹林對木糖葡萄球菌生物被膜的形成具有干預作用,并且對氮代謝和碳代謝有顯著影響。雖然IGPD在組氨酸的生物合成過程中發(fā)揮重要作用,并且能夠顯著影響生物被膜的形成,但通過BIAcore分子互作驗證,阿司匹林與IGPD在體外沒有結合,說明IGPD不是阿司匹林的作用靶標。
【學位授予單位】：東北農業(yè)大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2018
【分類號】：S852.61
【圖文】：

圖 2-1 RNA 提取路線路Figure 2-1 RNA extraction method2.2.5.2 cDNA 合成1、去除基因組 DNA 反應按下表比例加入各試劑，然后再分裝到每個反應管中，最后加入 RNA 樣品。表 2-1 反應體系Table 2-1 Reaction system試劑 使用量5×gDNA Eraser BuffergDNA EraserTotal RNARNase Free dH2OTotal2.0 μL1.0 μL5.0 μL2.0 μL10.0 μL

圖 3-1 亞抑菌濃度阿司匹林對木糖葡萄球菌生長的影響Figure 3-1 Effect of sub-MIC aspirin on growth curve of Staphylococcus xylosus3.3 亞抑菌濃度阿司匹林對木糖葡萄球菌生物被膜形成的干預作用3.3.1 阿司匹林對木糖葡萄球菌生物被膜影響通過結晶紫染色，在酶標儀 595 nm 波長下，測定 1/2 MIC（0.625 mg/mL）、1/4 MIC（0.3125mg/mL）、1/8 MIC（0.15625 mg/mL）和 1/16 MIC（0.078125 mg/mL）阿司匹林處理后生物被膜的 OD 值。如圖 3-2 所示，OD 值隨著藥物濃度的增大而減小，呈負相關。經過 SPSS 軟件分析，每個濃度的 OD 值與空白對照存在顯著性差異，p<0.05。說明阿司匹林對木糖葡萄球菌的生物被膜有顯著的干預作用。

抑菌濃度阿司匹林對木糖葡萄球菌生物被膜形成的vention of subinhibitory concentration of aspirin on bioStaphylococcus xylosus木糖葡萄球菌生物被膜的形態(tài)影響鏡（SEM），觀察經過 1/2 MIC 濃度阿司匹林（0.6糖葡萄球菌 ATCC 700404 生物被膜。如圖所示，A量黏附于蓋玻片表面，形成具有蘑菇狀三維立體結林（0.625 mg/mL）處理后，可明顯觀察到黏附于蓋黏附。并且經藥物處理后，細菌生物被膜的三維立可在體外對細菌生物被膜的形成有顯著的干預作用

【參考文獻】

相關博士學位論文 前2條

1 楊艷北;基于谷氨酰胺合成酶靶標探討紅霉素干預木糖葡萄球菌生物被膜形成的機制[D];東北農業(yè)大學;2017年

2 朱泳璋;百日咳桿菌的免疫蛋白質組學研究以及應用生物信息學方法篩選針對百日咳的新抗原和藥物靶點[D];中國協(xié)和醫(yī)科大學;2007年

相關碩士學位論文 前2條

1 張歡;基于核受體靶點的小分子設計及化學生物學研究[D];華僑大學;2015年

2 王丹;旋覆花倍半萜內酯類成分與TNF-α的相互作用及其抗炎活性研究[D];第二軍醫(yī)大學;2013年

本文編號：2789156