【摘要】：奶牛乳房炎不僅對(duì)奶牛業(yè)危害十分嚴(yán)重,而且也是導(dǎo)致奶牛淘汰的疾病之一。其中凝固酶陰性葡萄球菌如木糖葡萄球菌(Staphylococcus xylosus,S.xylosus)引起的感染呈上升趨勢(shì),阻礙奶牛行業(yè)的未來發(fā)展。雖然凝固酶陰性葡萄球菌在傳統(tǒng)觀念上被定義為低致病性病原菌,但最近幾年,全球很多地區(qū)凝固酶陰性葡萄球菌造成奶牛乳房炎的數(shù)量不斷上升,而且木糖葡萄球菌能形成成熟的生物被膜(biofilm,BF),并且BF可以互相黏附或者黏附到生物活性或非活性物體表面,使生物被膜內(nèi)細(xì)菌產(chǎn)生免疫逃避和耐藥性,導(dǎo)致奶牛乳房炎的感染遷延不愈。因此,對(duì)木糖葡萄球菌生物被膜調(diào)控機(jī)制的研究,尋找新型藥物作用靶標(biāo),提高奶牛乳房炎的預(yù)防和治療效果,已成為國內(nèi)外科研工作者關(guān)注的焦點(diǎn)之一。阿司匹林(Aspirin)別名乙酰水楊酸,是非甾體抗炎類藥物,除具有退燒、解熱和抗炎作用外,也能干預(yù)白色念珠菌、表皮葡萄球菌、大腸桿菌和銅綠假單胞菌生物被膜的形成,但關(guān)于阿司匹林對(duì)木糖葡萄球菌生物被膜形成的干預(yù)作用尚未見報(bào)道。故本研究擬通過iTRAQ技術(shù),在1/2 MIC阿司匹林作用下篩選木糖葡萄球菌生物被膜形成的差異表達(dá)蛋白,為確定阿司匹林的作用靶標(biāo)提供理論支持。在分析差異表達(dá)蛋白的基礎(chǔ)上,進(jìn)一步研究咪唑甘油磷酸酯脫水酶是否為阿司匹林的作用靶標(biāo)。具體研究結(jié)果如下:(1)利用微量稀釋法測(cè)定阿司匹林對(duì)木糖葡萄球菌最小抑菌濃度(MIC)為1.25 mg/mL;基于結(jié)晶紫染色和掃描電子顯微鏡的方法,揭示亞抑菌濃度的阿司匹林對(duì)生物被膜的干預(yù)作用,結(jié)果表明,1/2 MIC(0.625 mg/mL)、1/4 MIC(0.3125 mg/mL)、1/8 MIC(0.15625 mg/mL)和1/16 MIC(0.078125 mg/mL)的阿司匹林均能顯著抑制木糖葡萄球菌生物被膜形成,并且破壞生物被膜的立體結(jié)構(gòu)。(2)基于蛋白質(zhì)組學(xué)TRAQ技術(shù),對(duì)1/2 MIC(0.625 mg/mL)阿司匹林干預(yù)木糖葡萄球菌生物被膜差異表達(dá)蛋白質(zhì)進(jìn)行定量分析,揭示阿司匹林可能的作用靶標(biāo)。根據(jù)比值1.2or0.8(p-value0.05)的差異蛋白選擇標(biāo)準(zhǔn),共有178個(gè)差異表達(dá)蛋白被篩選并鑒定,其中67個(gè)(37.6%)蛋白上調(diào)表達(dá),111個(gè)(62.4%)蛋白下調(diào)表達(dá)。在上述蛋白中,經(jīng)過數(shù)據(jù)分析得到可能與生物被膜形成相關(guān)及在細(xì)菌代謝過程中發(fā)揮重要作用的蛋白,包括:咪唑甘油磷酸酯脫水酶(IGPD,A0A068E9J3)、組氨酸氨酶(huth,A0A060MSD4)、咪唑酮丙酸酶(hutI,A0A068E2P9)、尿刊酸水合酶(hutu,A0A068E633)、谷氨酰胺合成酶(GlnA,A0A068E8L1)、3-磷酸甘油醛脫氫酶(GAPDH,A0A060MH08)、磷酸谷胱甘肽酶(PGM,C6ZDJ7)、酮基酸還原異構(gòu)酶(KARI,A0A068E468)、3-異丙基蘋果酸脫氫酶(LeuB,A0A068E3H6)和異檸檬酸脫氫酶(IDH,A0A090K7P3)。通過GO分析表明,大多數(shù)差異表達(dá)蛋白主要富集在代謝過程中。KEGG通路數(shù)據(jù)庫分析發(fā)現(xiàn)大量的差異表達(dá)蛋白涉及氨基酸合成、碳代謝(磷酸戊糖和糖酵解途徑,三羧酸循環(huán))和氮代謝(組氨酸代謝)等途徑,所以這些重要蛋白可能是阿司匹林干預(yù)木糖葡萄球菌生物被膜形成的候選靶標(biāo)。在上述差異蛋白中,咪唑甘油磷酸酯脫水酶參與氮代謝中的組氨酸生物合成,而組氨酸對(duì)生物被膜的形成有顯著影響。所以本研究推測(cè)咪唑甘油磷酸酯脫水酶可能是阿司匹林的作用靶標(biāo),但是通過BIAcore分子互作試驗(yàn),結(jié)果表明阿司匹林與IGPD在體外沒有相互作用。綜上所述,阿司匹林對(duì)木糖葡萄球菌生物被膜的形成具有干預(yù)作用,并且對(duì)氮代謝和碳代謝有顯著影響。雖然IGPD在組氨酸的生物合成過程中發(fā)揮重要作用,并且能夠顯著影響生物被膜的形成,但通過BIAcore分子互作驗(yàn)證,阿司匹林與IGPD在體外沒有結(jié)合,說明IGPD不是阿司匹林的作用靶標(biāo)。
【學(xué)位授予單位】：東北農(nóng)業(yè)大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2018
【分類號(hào)】：S852.61
【圖文】：

圖 2-1 RNA 提取路線路Figure 2-1 RNA extraction method2.2.5.2 cDNA 合成1、去除基因組 DNA 反應(yīng)按下表比例加入各試劑，然后再分裝到每個(gè)反應(yīng)管中，最后加入 RNA 樣品。表 2-1 反應(yīng)體系Table 2-1 Reaction system試劑 使用量5×gDNA Eraser BuffergDNA EraserTotal RNARNase Free dH2OTotal2.0 μL1.0 μL5.0 μL2.0 μL10.0 μL

圖 3-1 亞抑菌濃度阿司匹林對(duì)木糖葡萄球菌生長的影響Figure 3-1 Effect of sub-MIC aspirin on growth curve of Staphylococcus xylosus3.3 亞抑菌濃度阿司匹林對(duì)木糖葡萄球菌生物被膜形成的干預(yù)作用3.3.1 阿司匹林對(duì)木糖葡萄球菌生物被膜影響通過結(jié)晶紫染色，在酶標(biāo)儀 595 nm 波長下，測(cè)定 1/2 MIC（0.625 mg/mL）、1/4 MIC（0.3125mg/mL）、1/8 MIC（0.15625 mg/mL）和 1/16 MIC（0.078125 mg/mL）阿司匹林處理后生物被膜的 OD 值。如圖 3-2 所示，OD 值隨著藥物濃度的增大而減小，呈負(fù)相關(guān)。經(jīng)過 SPSS 軟件分析，每個(gè)濃度的 OD 值與空白對(duì)照存在顯著性差異，p<0.05。說明阿司匹林對(duì)木糖葡萄球菌的生物被膜有顯著的干預(yù)作用。

抑菌濃度阿司匹林對(duì)木糖葡萄球菌生物被膜形成的vention of subinhibitory concentration of aspirin on bioStaphylococcus xylosus木糖葡萄球菌生物被膜的形態(tài)影響鏡（SEM），觀察經(jīng)過 1/2 MIC 濃度阿司匹林（0.6糖葡萄球菌 ATCC 700404 生物被膜。如圖所示，A量黏附于蓋玻片表面，形成具有蘑菇狀三維立體結(jié)林（0.625 mg/mL）處理后，可明顯觀察到黏附于蓋黏附。并且經(jīng)藥物處理后，細(xì)菌生物被膜的三維立可在體外對(duì)細(xì)菌生物被膜的形成有顯著的干預(yù)作用

【參考文獻(xiàn)】

相關(guān)博士學(xué)位論文 前2條

1 楊艷北;基于谷氨酰胺合成酶靶標(biāo)探討紅霉素干預(yù)木糖葡萄球菌生物被膜形成的機(jī)制[D];東北農(nóng)業(yè)大學(xué);2017年

2 朱泳璋;百日咳桿菌的免疫蛋白質(zhì)組學(xué)研究以及應(yīng)用生物信息學(xué)方法篩選針對(duì)百日咳的新抗原和藥物靶點(diǎn)[D];中國協(xié)和醫(yī)科大學(xué);2007年

相關(guān)碩士學(xué)位論文 前2條

1 張歡;基于核受體靶點(diǎn)的小分子設(shè)計(jì)及化學(xué)生物學(xué)研究[D];華僑大學(xué);2015年

2 王丹;旋覆花倍半萜內(nèi)酯類成分與TNF-α的相互作用及其抗炎活性研究[D];第二軍醫(yī)大學(xué);2013年

本文編號(hào)：2789156