【摘要】：布魯氏菌病(Brucellosis)是由兼性細胞內(nèi)寄生的布魯氏菌(Brucella)引起的人獸共患烈性傳染病,近年來在我國大部分地區(qū)再次流行,引起了嚴重的經(jīng)濟損失和公共衛(wèi)生問題。本論文旨在分析我國西北地區(qū)羊布魯氏菌分子流行病學(xué),了解布魯氏菌優(yōu)勢菌株及其菌株基因特征,追溯流行菌株的來源和變異情況;根據(jù)流行菌株基因組特征,選擇保守的免疫抗原蛋白,篩選有針對性的抗原表位多肽。從我國西北新疆、青海、甘肅和內(nèi)蒙古四省區(qū)一些地區(qū)采集羊和牦牛疑似感染布魯氏菌病流產(chǎn)胎兒的脾臟樣本480份,共分離鑒定布魯氏菌菌株66株,其中馬耳他布魯氏菌3型58株,馬耳他布魯氏菌1型1株,流產(chǎn)布魯氏菌1型2株,流產(chǎn)布魯氏菌3型3株和豬布魯氏菌3型2株;用MLVA和MLST基因分析技術(shù),對66株布魯氏菌菌株進行分子流行病學(xué)研究發(fā)現(xiàn),66株布魯氏菌分離株中包含46個MLVA16基因型,37株菌株擁有獨立特有的基因型,有一株為新的基因型(基因型369),其中基因型116(n=49)和ST8(n=53)為優(yōu)勢的基因型。MLVA16分析66株分離株的亨特-加斯頓多樣化指數(shù)(HGDI)表明,菌株間多樣化水平為0.979;以MLVA11進行分子流行病學(xué)分析表明,我國馬耳他布魯氏菌流行菌株的主要基因型為116,分離株MLVA16的鑒定分析有助于深入了解西北地區(qū)動物布魯氏菌病流行情況。首次對甘肅馬耳他布魯氏菌流行株分析發(fā)現(xiàn),其流行菌株的種類、基因型無規(guī)律性。分子流行病學(xué)比較表明,人感染布魯氏菌病主要來源于羊。甘肅慶陽地區(qū)2011-2015年間布魯氏菌血清流行情況分析表明,布魯氏菌年流行率在0.04%-4.75%之間,8個縣區(qū)年均流行率在0%-9.96%之間,布魯氏菌發(fā)病呈現(xiàn)上升趨勢,差異明顯;分離菌株分子流行病學(xué)結(jié)果表明,甘肅慶陽地區(qū)羊布魯氏菌不僅有本地區(qū)周圍的優(yōu)勢流行菌株,而且也存在外來菌株的混合感染。對分離于甘肅和青海的2株(羊源和牦牛源各1株)馬耳他布魯氏菌代表株全基因組測序分析,結(jié)果顯示全基因組相對保守,長度為3.3Mb,有兩個環(huán)狀染色體,但基因組上也存在數(shù)量不等的特異基因。應(yīng)用樹突狀細胞篩選布魯氏菌種間保守的Omp16和L7/L12免疫蛋白潛在的抗原表位多肽,小鼠免疫評價結(jié)果表明omp16-1和L7/L12-4為T細胞抗原表位多肽,能刺激細胞和免疫動物發(fā)揮細胞免疫功能;omp16-5能夠與布魯氏菌陽性血清發(fā)生強烈反應(yīng),也能發(fā)揮體液免疫功能�？傊�,我國西北地區(qū)羊主要流行馬耳他布魯氏菌3型菌株,優(yōu)勢基因型為116(MLVA11)和ST8(MLST),布魯氏菌菌株主要來自于東地中海布魯氏菌群,基因組保守度高;應(yīng)用DC能有效的篩選表位多肽抗原,并從Omp16和L7/L12蛋白上獲得了理想的表位多肽。
【學(xué)位授予單位】：中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2018
【分類號】：S855.12
【圖文】：

圖 1-1 不同省份 600 株布魯氏菌菌株傳播路線圖Fig1-1 The sketch map of the 600 Brucella strains from different provinces in this studye 1 (yellow line): Inner Mongolia, Heilongjiang, Liaoning- Shandong- Hebei- Beijing-Guangdong provincee 2 (green line): Xinjiang, Ningxia, Qinghai-Shanxi-Henan-Zhejiang-Guangxi-Fujian-Hainan provinces. Lick line) Shanxi-Henan-Jiangxi-Guangxi-Yunnan provinces. The size of the blue circle represented the totalber of the isolated strains (in a circle). The sketch map does not represent an administrative map in the legase..2 MLST多位點測序分型(Multilocus sequencing typing，MLST)最早設(shè)計用于研究腦膜炎奈瑟Neisseria meningitides)的自然變異，后來被廣泛的用于多種病原微生物和真核生物的研eng et al., 2011; Momeni et al., 2015)，該方法通過分析同一基因的等位基因核酸序列突到不同種型菌株之間的差異，其選擇分析的序列往往是看家基因�？醇一蛟诰曛械拇嬖�，但不同菌株間又有極小的差異，通過測定看家基因的核苷酸序列，找到變分散于基因組內(nèi)多個位點的變異情況，形成一種菌株共有的特征，從而將這些基因特組合與菌株進化建立起密切關(guān)系。MLST 設(shè)計往往是通過比較 GenBank 數(shù)據(jù)庫菌株看

通過抗原刺激活化后，再次移入患者體內(nèi)，激活產(chǎn)生特異的殺傷性 C胞(Saito et al., 2017)；新型的方法是通過抗原與 DC 表面受體融合方法原，體內(nèi)免疫后通過 DC 抗原交互提呈能力，活化特異性殺傷 CD8+細一方面，DC 疫苗的作用往往需要配伍佐劑以增強其功能(Chen et al., 20e, 2014)。研究的目的和意義來，我國大部分地區(qū)出現(xiàn)布魯氏菌病的再次流行，特別是在西北地區(qū)流采集我國西北地區(qū)疑似感染布魯氏菌引起流產(chǎn)動物樣本，進行細菌分離，全面了解我國西北地區(qū)布魯氏菌流行的優(yōu)勢菌株及其菌株特征，追溯異情況，以及分析流行菌株的全基因組特征；根據(jù)我國布魯氏菌流行選擇廣譜的免疫抗原蛋白為靶標(biāo)，進行表位多肽抗原的篩選，為布魯氏提供候選高效抗原。此外，通過我國動物布魯氏菌分子流行病學(xué)研究和的分析，能為布魯氏菌病防控中疫苗的選用提供有效的數(shù)據(jù)支撐。論文見圖 1-2。

圖 2-1 樣本采集分別圖Figure2-1. Distribution of samples.2 主要試劑及溶液布魯氏菌血清葡萄糖瓊脂（Brucella serum dextrose agar）和布魯氏（Brucella Medium Base and Brucella Selective Supplement）；購自LTM布魯氏菌培養(yǎng)基購自于每個 BD 公司；布魯氏菌馬血清；無菌的1 mol/L, pH 7.2)；硫化氫（H2S）檢測試紙（醋酸鉛）、硫堇(thionin, TH))檢測試紙；生化檢測用噬菌體(Tbilisi, Tb; Berkeley, Bk2; 和 Weybr異性抗血清由中國疫病預(yù)防與控制中心提供。DL2000TMDNAMarker、DNA 基因組提取試劑盒試劑盒和 EXTaq 擴增酶購自寶生物工試劑均為國產(chǎn)分析純。布魯氏菌血清葡萄糖瓊脂（Brucella serum dextrose agar）成分（1 L胨（Peptone） 10 gb-Lemco’powder 5

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本文編號：2788811