發(fā)布時間：2020-08-10 21:14

【摘要】：體細胞核移植(somatic cell nuclear transfer,SCNT)技術(shù)是轉(zhuǎn)基因新品種培育的主要技術(shù)手段,其優(yōu)點是不僅可以培育家畜優(yōu)良品種、有效保護瀕危動物,還為細胞分化以及基因調(diào)控機制的研究提供了重要的技術(shù)手段。目前,胎兒成纖維細胞是SCNT中使用最多的核供體細胞。盡管它具有良好的增殖能力,能夠用于細胞水平的基因修飾,并且利用它作為核供體細胞最終會產(chǎn)生成活的轉(zhuǎn)基因后代。但是,它作為核供體細胞,還具有基因轉(zhuǎn)染效率低、體外培養(yǎng)傳代次數(shù)有限等缺點,這會阻礙轉(zhuǎn)基因新品種的培育。存在于成體組織中的干細胞與胎兒成纖維細胞相比,具有取材方便、易培養(yǎng),增殖能力強、分化程度低等優(yōu)點,被廣泛應(yīng)用在轉(zhuǎn)基因新品種的培育以及再生醫(yī)學(xué)等多個領(lǐng)域。本研究以阿爾巴斯絨山羊胎兒成纖維細胞(Fetal fibroblast cells,FFCs)、脂肪間充質(zhì)干細胞(Adipose-derived stem cells,ADSCs)、骨髓間充質(zhì)干細胞(Bone marrow stromal cells,BMSCs)和肌肉衛(wèi)星細胞(Muscle-derived satellite cells,MDSCs)作為研究對象,比較其多能性、增殖、凋亡相關(guān)基因的表達情況,并通過全基因組甲基化、組蛋白H3乙酰化水平及其它乙�；稽c檢測,以及相關(guān)表觀遺傳修飾酶類的表達情況檢測,系統(tǒng)了解胎兒成纖維細胞和成體干細胞的體外生長特性及表觀遺傳修飾模式的差異,為深入探究成體干細胞和成纖維細胞的生長機制及表觀遺傳修飾差異提供新的實驗依據(jù)。同時,也為成體干細胞的應(yīng)用提供新的理論基礎(chǔ)。一、阿爾巴斯絨山羊胎兒成纖維細胞和成體干細胞的體外生長特性的比較本研究通過免疫細胞熒光、實時定量PCR及western blot比較了阿爾巴斯絨山羊ADSCs、BMSCs和MDSCs三種成體干細胞與FFCs中多能性(NANOG、OCT4、SOX2)、增殖(TERT、PCNA)、凋亡(P53、BAX)基因的表達。結(jié)果顯示,NANOG、OCT4和SOX2在gADSCs、gBMSCs和gMDSCs中低表達,且與gFFCs沒有明顯差異;在gBMSCs和gMDSCs中TERT的表達量高于gFFCs中的表達量,而在gADSCs中的表達量則低于gFFCs;PCNA和BAX在gFFCs和gMDSCs中高表達,在gADSCs和gBMSCs中低表達;P53在gBMSCs中的相對表達量較高,而在gFFCs、gADSCs和gMDSCs中的相對表達量均較低。二、阿爾巴斯絨山羊胎兒成纖維細胞和成體干細胞表觀遺傳修飾模式的比較為了深入探究表觀遺傳機制對成體干細胞的調(diào)節(jié)作用,本研究以阿爾巴斯絨山羊FFCs為對照,分析ADSCs、BMSCs和MDSCs的表觀遺傳修飾模式。結(jié)果顯示,gBMSCs基因組中5mC的含量低于gFFCs,而gADSCs和gMDSCs基因組中5mC的含量高于gFFCs;H3K9乙�；脚cgFFCs沒有明顯差異;gFFCs、gADSCs和gMDSCs可以檢測到乙酰化H3K9、H3K14、H3K18、H4K5和H4K12,但是gBMSCs幾乎檢測不到乙酰化H4K5和H4K12;DNMT1、DNMT3A和DNMT3B在gBMSCs和gMDSCs中的表達量較高;TET1和TET2在gFFCs、gADSCs、gBMSCs和gMDSCs中的表達量較低,而TET3表達較高且無明顯差異。HDAC1、HDAC6、SIRT1、Tip60、PCAF在gADSCs、gBMSCs和gMDSCs中的表達量均高于gFFCs,但是檢測不到P300表達。綜上所述,由于細胞來源的組織不同,取材的個體年齡也有差異,導(dǎo)致三種成體干細胞與胎兒成纖維細胞在不同層面上表現(xiàn)出各自優(yōu)勢。但是,從整體水平來看,成體干細胞的胚胎干細胞特性及增殖能力明顯優(yōu)于胎兒成纖維細胞;從表觀遺傳學(xué)角度來看,成體干細胞中表觀遺傳修飾表達活躍,明顯優(yōu)于胎兒成纖維細胞。表觀遺傳修飾在成體干細胞中活躍表達,表明其在成體干細胞中發(fā)揮重要的調(diào)控作用。本研究結(jié)果為成體干細胞在人類醫(yī)學(xué)和畜牧業(yè)等領(lǐng)域的應(yīng)用提供了新的思考。
【學(xué)位授予單位】：內(nèi)蒙古大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2018
【分類號】：S827
【圖文】：

圖 1.1 成體干細胞可塑性現(xiàn)象的可能機制[77]Fig 1.1 The possible mechanisms of plasticity in adult stem cells2 多能性、增殖、凋亡相關(guān)基因在胎兒成纖維細胞和成體干細胞中的研究.1 多能性相關(guān)基因在胎兒成纖維細胞和成體干細胞中的研究多能性（pluripotency），是指具有形成機體內(nèi)超過一種類型細胞的能力。2006 日本科山中伸彌（Yamanaka）發(fā)現(xiàn)小鼠胚胎成纖維細胞用 Oct4、Sox2、Klf4、c-Myc 這 4 個轉(zhuǎn)子可以重編程到多能性狀態(tài)。這一重大發(fā)現(xiàn)打開了干細胞多能性和重編程研究領(lǐng)域的大門

圖 1.5 人源 HDAC 的分類和結(jié)構(gòu)域示意圖[179]Fig 1.5 Diagram showing classification and domain structures of human HDACHDAC1、HDAC6 和 SIRT1 是研究最為廣泛的、也是最具代表性的三種組蛋白去乙酰化酶，它們分別屬于三種不同類型的 HDAC。其中，HDAC1 是哺乳動物中第一個被發(fā)現(xiàn)的組蛋白去乙酰化酶，屬于第一類 HDAC。它與其他多種蛋白質(zhì)結(jié)合形成復(fù)合物，催化組蛋白和非組蛋白的去乙�；腔蜣D(zhuǎn)錄的關(guān)鍵調(diào)控因子。有研究報道，HDAC1 不僅可以使核小體結(jié)構(gòu)發(fā)生改變，調(diào)節(jié)基因表達，還可以介導(dǎo)與 DNA 特異位點結(jié)合的轉(zhuǎn)錄抑制子的轉(zhuǎn)錄抑制作用[180]。此外，HDAC1 還參與調(diào)控細胞周期、增殖、分化和有絲分裂等重要的生理過程，因此其表達異常可導(dǎo)致細胞周期、生長、和分化等過程發(fā)生紊亂[181]。HDAC6 屬于 HDAC 家族的第二類，它編碼的蛋白質(zhì)是整個 HDAC 家族中最大的。大部分 HDAC 都位于細胞核中，但是第二類的 HDAC 可以在細胞質(zhì)與細胞核之間穿梭[175]。HDAC6 是唯一一種具有兩個催化位點的去乙�；福@是它不同于 HDAC 家族其它成員的一個重要特點[182, 183]。HDAC6 主

圖 2.1 gFFCs、gADSCs、gBMSCs 和 gMDSCs 四種細胞的貼壁形態(tài)貼壁形態(tài)。B：gADSCs 細胞的貼壁形態(tài)。C：gBMSCs 細胞的貼壁（標(biāo)尺：100 微米）ig 2.1 The adherent morphology of gFFCs, gADSCs, gBMSCs and gMDSorphology of gFFCs. B: The adherent morphology of gADSCs. C: The adhdherent morphology of gMDSCs. (Bar: 100 μm)

【參考文獻】

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本文編號：2788621