【摘要】：體細(xì)胞核移植(somatic cell nuclear transfer,SCNT)技術(shù)是轉(zhuǎn)基因新品種培育的主要技術(shù)手段,其優(yōu)點(diǎn)是不僅可以培育家畜優(yōu)良品種、有效保護(hù)瀕危動(dòng)物,還為細(xì)胞分化以及基因調(diào)控機(jī)制的研究提供了重要的技術(shù)手段。目前,胎兒成纖維細(xì)胞是SCNT中使用最多的核供體細(xì)胞。盡管它具有良好的增殖能力,能夠用于細(xì)胞水平的基因修飾,并且利用它作為核供體細(xì)胞最終會(huì)產(chǎn)生成活的轉(zhuǎn)基因后代。但是,它作為核供體細(xì)胞,還具有基因轉(zhuǎn)染效率低、體外培養(yǎng)傳代次數(shù)有限等缺點(diǎn),這會(huì)阻礙轉(zhuǎn)基因新品種的培育。存在于成體組織中的干細(xì)胞與胎兒成纖維細(xì)胞相比,具有取材方便、易培養(yǎng),增殖能力強(qiáng)、分化程度低等優(yōu)點(diǎn),被廣泛應(yīng)用在轉(zhuǎn)基因新品種的培育以及再生醫(yī)學(xué)等多個(gè)領(lǐng)域。本研究以阿爾巴斯絨山羊胎兒成纖維細(xì)胞(Fetal fibroblast cells,FFCs)、脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞(Adipose-derived stem cells,ADSCs)、骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(Bone marrow stromal cells,BMSCs)和肌肉衛(wèi)星細(xì)胞(Muscle-derived satellite cells,MDSCs)作為研究對(duì)象,比較其多能性、增殖、凋亡相關(guān)基因的表達(dá)情況,并通過全基因組甲基化、組蛋白H3乙�；郊捌渌阴；稽c(diǎn)檢測,以及相關(guān)表觀遺傳修飾酶類的表達(dá)情況檢測,系統(tǒng)了解胎兒成纖維細(xì)胞和成體干細(xì)胞的體外生長特性及表觀遺傳修飾模式的差異,為深入探究成體干細(xì)胞和成纖維細(xì)胞的生長機(jī)制及表觀遺傳修飾差異提供新的實(shí)驗(yàn)依據(jù)。同時(shí),也為成體干細(xì)胞的應(yīng)用提供新的理論基礎(chǔ)。一、阿爾巴斯絨山羊胎兒成纖維細(xì)胞和成體干細(xì)胞的體外生長特性的比較本研究通過免疫細(xì)胞熒光、實(shí)時(shí)定量PCR及western blot比較了阿爾巴斯絨山羊ADSCs、BMSCs和MDSCs三種成體干細(xì)胞與FFCs中多能性(NANOG、OCT4、SOX2)、增殖(TERT、PCNA)、凋亡(P53、BAX)基因的表達(dá)。結(jié)果顯示,NANOG、OCT4和SOX2在gADSCs、gBMSCs和gMDSCs中低表達(dá),且與gFFCs沒有明顯差異;在gBMSCs和gMDSCs中TERT的表達(dá)量高于gFFCs中的表達(dá)量,而在gADSCs中的表達(dá)量則低于gFFCs;PCNA和BAX在gFFCs和gMDSCs中高表達(dá),在gADSCs和gBMSCs中低表達(dá);P53在gBMSCs中的相對(duì)表達(dá)量較高,而在gFFCs、gADSCs和gMDSCs中的相對(duì)表達(dá)量均較低。二、阿爾巴斯絨山羊胎兒成纖維細(xì)胞和成體干細(xì)胞表觀遺傳修飾模式的比較為了深入探究表觀遺傳機(jī)制對(duì)成體干細(xì)胞的調(diào)節(jié)作用,本研究以阿爾巴斯絨山羊FFCs為對(duì)照,分析ADSCs、BMSCs和MDSCs的表觀遺傳修飾模式。結(jié)果顯示,gBMSCs基因組中5mC的含量低于gFFCs,而gADSCs和gMDSCs基因組中5mC的含量高于gFFCs;H3K9乙酰化水平與gFFCs沒有明顯差異;gFFCs、gADSCs和gMDSCs可以檢測到乙�；疕3K9、H3K14、H3K18、H4K5和H4K12,但是gBMSCs幾乎檢測不到乙酰化H4K5和H4K12;DNMT1、DNMT3A和DNMT3B在gBMSCs和gMDSCs中的表達(dá)量較高;TET1和TET2在gFFCs、gADSCs、gBMSCs和gMDSCs中的表達(dá)量較低,而TET3表達(dá)較高且無明顯差異。HDAC1、HDAC6、SIRT1、Tip60、PCAF在gADSCs、gBMSCs和gMDSCs中的表達(dá)量均高于gFFCs,但是檢測不到P300表達(dá)。綜上所述,由于細(xì)胞來源的組織不同,取材的個(gè)體年齡也有差異,導(dǎo)致三種成體干細(xì)胞與胎兒成纖維細(xì)胞在不同層面上表現(xiàn)出各自優(yōu)勢。但是,從整體水平來看,成體干細(xì)胞的胚胎干細(xì)胞特性及增殖能力明顯優(yōu)于胎兒成纖維細(xì)胞;從表觀遺傳學(xué)角度來看,成體干細(xì)胞中表觀遺傳修飾表達(dá)活躍,明顯優(yōu)于胎兒成纖維細(xì)胞。表觀遺傳修飾在成體干細(xì)胞中活躍表達(dá),表明其在成體干細(xì)胞中發(fā)揮重要的調(diào)控作用。本研究結(jié)果為成體干細(xì)胞在人類醫(yī)學(xué)和畜牧業(yè)等領(lǐng)域的應(yīng)用提供了新的思考。
【學(xué)位授予單位】：內(nèi)蒙古大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2018
【分類號(hào)】：S827
【圖文】：

圖 1.1 成體干細(xì)胞可塑性現(xiàn)象的可能機(jī)制[77]Fig 1.1 The possible mechanisms of plasticity in adult stem cells2 多能性、增殖、凋亡相關(guān)基因在胎兒成纖維細(xì)胞和成體干細(xì)胞中的研究.1 多能性相關(guān)基因在胎兒成纖維細(xì)胞和成體干細(xì)胞中的研究多能性（pluripotency），是指具有形成機(jī)體內(nèi)超過一種類型細(xì)胞的能力。2006 日本科山中伸彌（Yamanaka）發(fā)現(xiàn)小鼠胚胎成纖維細(xì)胞用 Oct4、Sox2、Klf4、c-Myc 這 4 個(gè)轉(zhuǎn)子可以重編程到多能性狀態(tài)。這一重大發(fā)現(xiàn)打開了干細(xì)胞多能性和重編程研究領(lǐng)域的大門

圖 1.5 人源 HDAC 的分類和結(jié)構(gòu)域示意圖[179]Fig 1.5 Diagram showing classification and domain structures of human HDACHDAC1、HDAC6 和 SIRT1 是研究最為廣泛的、也是最具代表性的三種組蛋白去乙�；�，它們分別屬于三種不同類型的 HDAC。其中，HDAC1 是哺乳動(dòng)物中第一個(gè)被發(fā)現(xiàn)的組蛋白去乙�；福瑢儆诘谝活� HDAC。它與其他多種蛋白質(zhì)結(jié)合形成復(fù)合物，催化組蛋白和非組蛋白的去乙�；腔蜣D(zhuǎn)錄的關(guān)鍵調(diào)控因子。有研究報(bào)道，HDAC1 不僅可以使核小體結(jié)構(gòu)發(fā)生改變，調(diào)節(jié)基因表達(dá)，還可以介導(dǎo)與 DNA 特異位點(diǎn)結(jié)合的轉(zhuǎn)錄抑制子的轉(zhuǎn)錄抑制作用[180]。此外，HDAC1 還參與調(diào)控細(xì)胞周期、增殖、分化和有絲分裂等重要的生理過程，因此其表達(dá)異�？蓪�(dǎo)致細(xì)胞周期、生長、和分化等過程發(fā)生紊亂[181]。HDAC6 屬于 HDAC 家族的第二類，它編碼的蛋白質(zhì)是整個(gè) HDAC 家族中最大的。大部分 HDAC 都位于細(xì)胞核中，但是第二類的 HDAC 可以在細(xì)胞質(zhì)與細(xì)胞核之間穿梭[175]。HDAC6 是唯一一種具有兩個(gè)催化位點(diǎn)的去乙酰化酶，這是它不同于 HDAC 家族其它成員的一個(gè)重要特點(diǎn)[182, 183]。HDAC6 主

圖 2.1 gFFCs、gADSCs、gBMSCs 和 gMDSCs 四種細(xì)胞的貼壁形態(tài)貼壁形態(tài)。B：gADSCs 細(xì)胞的貼壁形態(tài)。C：gBMSCs 細(xì)胞的貼壁（標(biāo)尺：100 微米）ig 2.1 The adherent morphology of gFFCs, gADSCs, gBMSCs and gMDSorphology of gFFCs. B: The adherent morphology of gADSCs. C: The adhdherent morphology of gMDSCs. (Bar: 100 μm)

【參考文獻(xiàn)】

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本文編號(hào)：2788621