【摘要】：脛骨軟骨發(fā)育不良(TD)是禽類常見的骨骼疾病。這種疾病的病因和發(fā)病機制仍不清楚。腸道菌群是一個復(fù)雜的生態(tài)系統(tǒng),對人類和動物的健康起著非常重要的作用。許多研究已將疾病與腸道菌群的失調(diào)聯(lián)系起來。然而,很少有人知道腸道菌群是否在TD中發(fā)揮作用。炎癥是機體抵御外界刺激所做出的重要防御性反應(yīng),然而,過度的炎癥反應(yīng)會對機體造成不同程度的損傷。已有大量研究將炎癥與諸多疾病的發(fā)生和發(fā)展過程聯(lián)系在了一起,包括骨骼疾病。也有研究表明,炎癥對骨骼的生長發(fā)育過程起抑制作用。然而,關(guān)于全身性炎癥反應(yīng)是否會導(dǎo)致骨形成異常甚至引起骨骼疾病的發(fā)生及其潛在機制目前仍知之甚少,而肉雞在這方面的研究則更少。本實驗的目的即是用福美雙和脂多糖(LPS)在肉雞當(dāng)中分別建立TD發(fā)病模型和全身性炎癥模型,以脛骨為研究對象,探究腸道菌群的變化和炎癥反應(yīng)是否會對肉雞骨骼的生長發(fā)育及骨骼疾病的發(fā)生產(chǎn)生影響。1.患脛骨軟骨發(fā)育不良肉雞的腸道菌群變化情況為探討福美雙誘導(dǎo)TD肉雞的小腸和大腸菌群的多樣性和組成情況,從3日齡開始使用福美雙飼料拌服的方法誘導(dǎo)肉雞TD的發(fā)病,拌服劑量為100 mg/kg。在18日齡分別采集健康和TD肉雞的大小腸內(nèi)容物,通過高通量測序方法擴增和測序16S rDNA的V3-V4區(qū)域,并對測序結(jié)果進行分析。研究結(jié)果表明,健康肉雞腸道菌群的豐度和多樣性高于TD肉雞,但差異性不顯著(P0.05)。然而,健康和TD肉雞之間的腸道菌群組成情況存在顯著差異(P0.05)。與健康肉雞相比,TD肉雞的腸道菌群中與免疫和炎癥相關(guān)的腸道菌群的OTU豐度顯著增高。結(jié)果表明,健康肉雞和TD肉雞之間的腸道菌群存在一定差異性,且這種差異性可能與機體免疫能力和炎癥相關(guān)聯(lián),這為TD發(fā)病機制的研究提供了新思路。2.LPS誘導(dǎo)的全身性炎癥反應(yīng)對肉雞骨形成過程的影響本研究利用LPS按2mg/kg的劑量,通過腹腔注射的方式建立肉雞全身性炎癥模型,探討炎癥對肉雞骨骼生長發(fā)育的影響。研究發(fā)現(xiàn),LPS組的生產(chǎn)性能和生長效率低下,血小板和炎性細胞數(shù)量大量增加,血清中的炎性因子、GC以及RANKL的水平顯著升高,而OPG的水平則明顯下降。另外,血清生化檢測結(jié)果擇暗示LPS組肉雞肝功能異常和鈣磷代謝紊亂。通過組織病理學(xué)方法觀察發(fā)現(xiàn),LPS組脛骨生長板區(qū)域血管數(shù)量減少,并且出現(xiàn)微血栓結(jié)構(gòu),另外生長板肥大區(qū)軟骨細胞發(fā)生核溶解現(xiàn)象,破骨細胞數(shù)量明顯增加。檢測在炎癥和骨形成中起關(guān)鍵作用的各基因mRNA和蛋白表達水平的結(jié)果顯示,與對照組相比,LPS組TLR4,NF-κB,TF,TPO及其受體C-MPL還有MMP-9及其誘導(dǎo)因子CD147的mRNA表達水平增強,而VEGFA則受到抑制。在OPG/RANKL系統(tǒng)中,LPS組中OPG的mRNA水平降低,而RANKL表達增強。蛋白水平的結(jié)果顯示LPS組中NF-κB、CD147和MMP-9的表達量均升高,而VEGFA和OPG則降低。因此,我們推斷炎癥可以抑制骨塑建和骨重塑過程,繼而影響肉雞骨形成。這與機體中血栓形成作用增強,而血管生成作用減弱,成骨作用紊亂及骨細胞外基質(zhì)降解有關(guān)。綜上所述,本研究的主要結(jié)論為:1.肉雞TD的發(fā)生可能與腸道菌群的變化存在聯(lián)系。TD的肉雞腸道菌群豐度及多樣性均低于健康肉雞,同時,與健康肉雞相比,TD肉雞中一些與免疫和炎癥相關(guān)的腸道菌群處于較高豐度,這可能是TD發(fā)生的潛在原因之一。2.全身性炎癥反應(yīng)對肉雞脛骨骨形成過程起著負面影響,這種影響通過抑制肉雞骨形成過程中的骨塑建和骨重塑以及骨細胞外基質(zhì)的降解來實現(xiàn)。
【學(xué)位授予單位】：華中農(nóng)業(yè)大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2019
【分類號】：S858.31
【圖文】：

圖 1-1 骨形成過程Fig. 1-1 bone formation.4.1 骨塑建骨塑建即是一個新生骨成骨過程，該過程從出生前的胚胎期就已開始，主要在動物幼年時期。成骨有兩種形式：膜內(nèi)成骨和軟骨內(nèi)成骨。由間充質(zhì)細胞分成骨細胞，隨后直接形成骨組織的過程稱為膜內(nèi)成骨，其主要形成以顱骨、髂

圖 1-2 炎癥對成骨作用的影響Fig. 1-2 the influence of inflammation on osteogenesis(modified from Thummuri et al 2015)炎癥影響骨形成過程的另一重要機制是糖皮質(zhì)激素（glucocorticoid, GC）信傳遞。內(nèi)源性糖皮質(zhì)激素的循環(huán)水平在炎癥發(fā)生期間增加，抑制軟骨細胞的增礦化（Cirillo et al 2017）。雖然生理水平的糖皮質(zhì)激素可以促進成骨細胞的分化是高水平的循環(huán)糖皮質(zhì)激素會通過減少成骨細胞蛋白的合成，促進細胞凋亡而成骨細胞的數(shù)量（Reid et al 1998, Weinstein et al 1998）。這一作用破壞了骨生骨吸收之間的平衡狀態(tài)，導(dǎo)致骨量丟失，骨組織受損。另外，還有研究表明，系統(tǒng)中高水平存在的 GC 還會增加血液高凝狀態(tài)的風(fēng)險，繼而阻礙血液運輸營質(zhì)，對骨形成造成負面影響（Cao et al 2017）。 腸道微生物群對骨骼的影響

及骨量維持方面具有重要調(diào)節(jié)作用的維生素（Contreras et al 2012）。更重腸道微生物群可以通過其自身或其所釋放的代謝產(chǎn)物直接或間接的與機體發(fā)生接觸，刺激免疫系統(tǒng)發(fā)揮作用。免疫細胞，包括 T 細胞和樹突狀細胞過與腸道內(nèi)壁微生物群的相互作用而遷移至淋巴結(jié)中，激活促炎或抗炎免Belkaid et al 2014）。這些免疫細胞還可以將炎性介質(zhì)或細胞因子釋放到循中，對全身的骨組織穩(wěn)態(tài)維持產(chǎn)生影響（Li et al 2007）。另外，通過將微分子模式（microbial associated molecular patterns, MAMPs）釋放進入循環(huán)系微生物群也可以對機體骨組織產(chǎn)生影響。例如 LPS 和鞭毛蛋白等就是最為AMP，它們分子量足夠小，可以順利穿透腸粘膜屏障而進入循環(huán)系統(tǒng)，一包括骨骼在內(nèi)遠端器官，MAMP 即可激活免疫應(yīng)答反應(yīng)，產(chǎn)生局部tgieter et al 2015）。然而，由于骨組織與腸道相對較長的生理學(xué)距離，使道微生物對骨骼影響的研究尚不深入，而近幾年高通量測序技術(shù)的長足發(fā)領(lǐng)域的深入研究提供了可能。

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本文編號：2788696