【摘要】：松花粉、黃芪作為具有殺菌、抗氧化、抗病毒和提高生物機(jī)體免疫機(jī)能等作用的中藥原材料,包含大量的營(yíng)養(yǎng)成分和生物活性物質(zhì),現(xiàn)已廣泛應(yīng)用在治療多種細(xì)菌性疾病,并在研究抑制瘤細(xì)胞和人乳頭瘤病毒等方面有了突破性進(jìn)展,對(duì)人和動(dòng)物的健康大有裨益。現(xiàn)今植物多糖的研究越來(lái)越受到重視,多糖作為一個(gè)新興的研究對(duì)象被國(guó)際科學(xué)界認(rèn)為是21世紀(jì)的最主要的科學(xué)主題之一。相關(guān)研究證實(shí),具有生物活性的多糖是植物細(xì)胞中的最主要的功能物質(zhì),而其生物活性主要表現(xiàn)在:免疫調(diào)節(jié)、抗腫瘤、降血壓、抗氧化、抗輻射、抗菌、保護(hù)機(jī)體重要免疫器官等,植物多糖作為一種具有免疫調(diào)節(jié)的活性物質(zhì)已被人們廣泛運(yùn)用到眾多領(lǐng)域中。常用的植物活性多糖的提取方法如水提法和物理化學(xué)法存在耗時(shí)長(zhǎng)、產(chǎn)量低、有機(jī)化學(xué)試劑使用多和操作繁瑣等問(wèn)題,使得植物活性多糖的總體產(chǎn)量不高,這極大地影響了植物多糖在畜牧業(yè)生產(chǎn)中的大量推廣應(yīng)用。為了解決以上傳統(tǒng)提取植物活性多糖過(guò)程中的各種問(wèn)題,我們使用一種產(chǎn)纖維素酶細(xì)菌進(jìn)行多糖植物的發(fā)酵,以期獲得一種操作簡(jiǎn)單、無(wú)有機(jī)化學(xué)使用、成本低廉的植物多糖提取方法。本研究以具有產(chǎn)纖維素酶特性的地衣芽孢桿菌(Bacillus licheniformis)在產(chǎn)酶發(fā)酵培養(yǎng)基中產(chǎn)生纖維素酶分別酶解松花粉、黃芪粉和破壁松花粉的植物細(xì)胞壁以釋放細(xì)胞內(nèi)的活性多糖,用80%乙醇分別提取發(fā)酵液中的松花粉多糖(Pinus massoniana pollen polysaccharides,PPPS)、黃芪多糖(Astragalus mongholicus polysaccharides,APS)、破壁松花粉多糖(Broken Pinus massoniana pollen polysaccharides,BPPPS)。將獲得的三種多糖植物提取物進(jìn)行HPLC法鑒定,證明了三種提取物的主要成分是多糖。以濃硫酸-苯酚法測(cè)定不同時(shí)間點(diǎn)三種多糖植物提取物中的多糖含量,結(jié)果表明,PPPS、APS、BPPPS的最高提取量分別為3.08g/100g、5.85g/100g、8.43g/100g;分別是水提法的1.4倍、2.5倍、3倍;是物理化學(xué)法的0.7倍、1.3倍、1.8倍。纖維素酶活性的檢測(cè)結(jié)果表明,在不同時(shí)間點(diǎn)纖維素酶活性呈現(xiàn)動(dòng)態(tài)變化,且不同組合的纖維素酶活性呈現(xiàn)不同的變化規(guī)律。為檢驗(yàn)獲得的植物多糖發(fā)酵提純產(chǎn)物的免疫調(diào)節(jié)作用,我們選取PRRSV GP5亞單位作為免疫原工具進(jìn)行試驗(yàn),以初步探索多糖提取物在GP5誘導(dǎo)的細(xì)胞免疫、體液免疫等方面具有如何的免疫調(diào)節(jié)作用。豬繁殖與呼吸綜合征(Porcine reproductive and respiratory syndrome,PRRS)是由豬繁殖與呼吸綜合征病毒(Porcine reproductive and respiratory syndrome virus,PRRSV)引起的一種以母豬繁殖障礙和新生仔豬呼吸道病變?yōu)樘卣鞯木哂懈叨冉佑|性和傳染性的疾病,目前對(duì)預(yù)防PRRS的商品化疫苗以弱毒活疫苗為主,但在實(shí)際應(yīng)用中仍存在各種各樣的問(wèn)題。根據(jù)實(shí)驗(yàn)室之前構(gòu)建的PRRSV GP5蛋白表達(dá)純化的方法,將高致病性PRRSV囊膜糖蛋白5(GP5)進(jìn)行原核表達(dá)并純化的GP5蛋白作為免疫原,不同濃度的PPPS、APS、BPPPS作為免疫佐劑,制成亞單位疫苗。選取44只健康家兔,隨機(jī)分為11組,分別在試驗(yàn)的第0天和14天進(jìn)行首次免疫和二次免疫。第1組免疫純化的GP5蛋白,第2-4組免疫不同濃度的PPPS(100、200、400 mg/mL)與GP5蛋白,第5-7組免疫不同濃度的APS(100、200、400 mg/mL)與GP5蛋白,第8-10組免疫不同濃度的BPPPS(100、200、400 mg/mL)與GP5蛋白,第11組注射滅菌生理鹽水(SPSS),2周后加強(qiáng)免疫1次。每周采取每組家兔的外周血,以ELISA法檢測(cè)血清中的GP5抗體效價(jià),以MTT法檢測(cè)外周血淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化率,以ELISA試劑盒分別檢測(cè)外周血中IL-2及IFN-γ細(xì)胞因子濃度。試驗(yàn)結(jié)果表明,所有疫苗組的以上免疫指標(biāo)均有所上升,特別是以高濃度多糖為佐劑的疫苗組相較于GP5組和SPSS組有顯著提高(P0.05)。PRRSV GP5蛋白誘導(dǎo)了特異性免疫應(yīng)答反應(yīng),PPPS、APS和BPPPS作為佐劑對(duì)GP5蛋白起到了顯著的免疫增強(qiáng)作用。本試驗(yàn)采用產(chǎn)纖維素酶地衣芽孢桿菌發(fā)酵三種多糖植物的多糖提取率較水提法和物理化學(xué)法均有顯著提高,其中最高倍數(shù)分別達(dá)到3倍和1.8倍。以三種植物多糖提取物作為免疫佐劑作用于PRRSV GP5蛋白亞單位疫苗可顯著提高其誘導(dǎo)細(xì)胞免疫和體液免疫指標(biāo),初步證明了這種方法獲得的多糖提取物具有良好的免疫增強(qiáng)作用。本研究為更加高效、低成本的提取植物多糖作了有益探索,使其在畜牧業(yè)生產(chǎn)中大量推廣使用提供技術(shù)貯備。
【學(xué)位授予單位】：山東農(nóng)業(yè)大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2019
【分類(lèi)號(hào)】：S853.74
【圖文】：

圖 1 地衣芽孢桿菌在 LB 培養(yǎng)基上生長(zhǎng)Fig.1 Bacillus licheniformis cultured on LB culture medium

stive Control; 2: Bacillus licheniformis; 3:圖 2 地衣芽孢桿菌 16S rRNA 鑒定 16S rRNA identification of Bacillus lichen

圖 3 多糖標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)Fig.3 Standard curve of polysaccharide糖標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)糖質(zhì)量（mg）為橫坐標(biāo)，OD487的讀數(shù)為縱坐標(biāo)，繪制出的還原

【參考文獻(xiàn)】

相關(guān)期刊論文 前10條

1 趙晴晴;李群輝;朱杰;鐘蕾;劉晶晶;顧敏;王曉泉;劉文博;劉秀梵;;一株鴨源H4N8亞型禽流感病毒的全基因測(cè)序及遺傳進(jìn)化分析[J];中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué);2015年15期

2 劉風(fēng)波;崔建民;閆芳;;非典型性新城疫的發(fā)病原因及診斷防制[J];國(guó)外畜牧學(xué)(豬與禽);2014年09期

3 尤s

本文編號(hào)：2786159