【摘要】：口蹄疫(Foot-and-Mouth Disease,FMD)是由口蹄疫病毒(Foot-and-Mouth Disease viruse,FMDV)引起偶蹄動物感染的一種急性、熱性、高度接觸傳染性的動物疫病。世界動物衛(wèi)生組織(OIE)將其列為必須報(bào)告的頭號烈性傳染病,我國將其列為Ⅰ類動物傳染病。作為畜牧業(yè)大國之一,我國每年飼養(yǎng)豬、牛、羊等多達(dá)18億頭�？谔阋叩谋l(fā)和流行對我國養(yǎng)殖業(yè)造成了嚴(yán)重危害。目前,FMDV感染的致病機(jī)制仍未完全揭示。FMDV作為一種專性活細(xì)胞內(nèi)寄生的生物,在FMDV復(fù)制復(fù)合物形成的過程中,病毒蛋白與宿主蛋白發(fā)生廣泛的相互作用。前期我們利用免疫共沉淀技術(shù),發(fā)現(xiàn)FMDV的非結(jié)構(gòu)蛋白3A可以與宿主波形蛋白(Vimentin)相互作用,為研究其作用機(jī)制進(jìn)行了以下研究:1、利用GST-pull down和激光共聚焦共定位的方法確定FMDV 3A與vimentin之間的相互作用。為了進(jìn)一步確定3A與vimentin互作的關(guān)鍵氨基酸位點(diǎn),研究表明該FMDV 3A存在多個(gè)氨基酸位點(diǎn)與vimentin相互作用,將FMDV 3A蛋白進(jìn)行丙氨酸突變掃描,通過GST-pull down的方法進(jìn)行鑒定,結(jié)果表明FMDV 3A蛋白上第15-21位氨基酸是與vimentin互作的關(guān)鍵氨基酸。這說明FMDV 3A與vimentin相互作用的位點(diǎn)位于FMDV 3A蛋白的N端。2、本研究將FMDV感染后不同時(shí)間點(diǎn)的細(xì)胞分別進(jìn)行免疫熒光實(shí)驗(yàn)Westernblotting和Real time PCR分析。免疫熒光實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明:FMDV感染PK-15細(xì)胞可導(dǎo)致vimentin在細(xì)胞內(nèi)的分布發(fā)生變化,正常細(xì)胞中vimentin均勻分布在細(xì)胞質(zhì)中,隨著病毒感染時(shí)間的延長(3 h-4 h),vimentin聚集在細(xì)胞核一側(cè),在病毒感染后5 h,vimentin呈“籠子”結(jié)構(gòu)聚集在細(xì)胞核周圍,且FMDV感染細(xì)胞1 h-5 h,3A與vimentin始終共定位。Westernblotting和Real time PCR結(jié)果表明:在FMDV感染初期,宿主vimentin蛋白表達(dá)水平和mRNA轉(zhuǎn)錄水平有短暫的下降,隨著FMDV感染時(shí)間的延長,宿主vimentin蛋白表達(dá)水平和mRNA轉(zhuǎn)錄水平逐漸升高,但在FMDV感染的過程中,宿主vimentin蛋白沒有被切割。這說明FMDV感染導(dǎo)致宿主vimentin發(fā)生重排,且vimentin發(fā)生重排不是由于vimentin被切割導(dǎo)致。在FMDV感染過程中,vimentin這種先下降后升高的表達(dá)方式與FMDV感染后與宿主之間復(fù)雜的相互作用有關(guān),vimentin蛋白可能參與FMDV感染的多個(gè)過程,而且在不同的過程中發(fā)揮著不同的作用,從而使得vimentin蛋白表達(dá)相應(yīng)地在不同時(shí)間出現(xiàn)差異。3、將外源表達(dá)的vimentin進(jìn)行純化復(fù)性,并利用vimentin蛋白阻斷PRRSV侵染Marc-145細(xì)胞,以驗(yàn)證復(fù)性后vimentin具有生物活性,再將其與FMDV感作2 h后侵染細(xì)胞,利用Real time PCR(絕對定量)檢測病毒感染12 h后細(xì)胞內(nèi)病毒拷貝數(shù),發(fā)現(xiàn)vimentin并沒有對FMDV感染造成影響。隨后又通過細(xì)胞流式法確定vimentin僅分布于細(xì)胞質(zhì)基質(zhì)中,而不存在于細(xì)胞外膜表面。表明vimentin在FMDV的吸附和進(jìn)入細(xì)胞的過程中不發(fā)揮作用。綜上,這些實(shí)驗(yàn)結(jié)果證明vimentin在FMDV吸附和侵入細(xì)胞的過程中不發(fā)揮作用,但在FMDV感染過程中可與FMDV 3A蛋白相互作用,為深入闡明FMDV感染致病機(jī)制提供重要信息,為預(yù)防和控制FMDV感染提供新思路。
【學(xué)位授予單位】：西北民族大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2018
【分類號】：S852.65
【圖文】：

2.4.3 激光共聚焦掃描觀察在共聚焦專用載玻片上滴一滴去離子水，小心取出爬片，使其背面朝上置玻片水滴上，并確保無氣泡產(chǎn)生，加一滴 10%的甘油于爬片背面，倒置于激聚焦顯微鏡載物臺上，用DIPA、FITC、Cy3激發(fā)光激發(fā)熒光，觀察3A與vimen置分布并拍照記錄結(jié)果。2.5 丙氨酸掃描確定 3A 關(guān)鍵結(jié)合位點(diǎn)以 3A 氨基酸序列中相鄰的 7 個(gè)氨基酸為一組，逐個(gè)進(jìn)行丙氨酸突變掃描（ 2-1），共獲得 22 個(gè) 3A 突變體，由金唯智公司合成。將這些質(zhì)粒進(jìn)行轉(zhuǎn)化導(dǎo)表達(dá)，與 vimentin 進(jìn)行 GST-pull down，以驗(yàn)證與 vimentin 結(jié)合的 3A 關(guān)用氨基酸位點(diǎn)。Westernblotting 檢測時(shí)，一抗分別為鼠源抗 GST 單抗印跡 3源抗 vimentin 單抗印跡波形蛋白。

以質(zhì)粒 pSKM1234 為模板，用設(shè)計(jì)的特異性引物通過 PCR 擴(kuò)增 3A 片段，進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳檢測分析，擴(kuò)增條帶大小與預(yù)期值相符（如圖 2-2）。圖2-2 目的基因3A的擴(kuò)增Fig.2-2 The PCR Amplication for 3AM:DNA 分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn);1:PCR 擴(kuò)增產(chǎn)物M:1Kb DNAmarker; 1:3Agene Amplified by PCR3.1.2 構(gòu)建誘餌重組質(zhì)粒將 PCR 擴(kuò)增的 3A 經(jīng) Bam H I 和 Not I 雙酶切后，插入 pGEX-6p-1 載體的相同酶切位點(diǎn)上，獲得 3A-pGEX-6p-1 重組質(zhì)粒，送上海生物工程有限公司測序成功，且結(jié)果表明 3A 已成功插入 pGEX-6p-1 載體中。3.1.3 重組 3A 的誘導(dǎo)表達(dá)及 Westernblotting 鑒定將重組質(zhì)粒 3A-pEGX-6p1 轉(zhuǎn)化 E.coli BL21(DE3)感受態(tài)細(xì)胞，經(jīng) IPTG 誘導(dǎo)后，超聲破碎菌體，離心取上清和沉淀分別進(jìn)行 SDS-PAGE 分析。GST 標(biāo)簽大小為 26 KD 左右，所以預(yù)期目的蛋白大小為 46 KD

M 1 2 3因此可鑒定表達(dá)產(chǎn)物為預(yù)期重組蛋白（見圖 2-4)。圖2-3 重組菌3A表達(dá)產(chǎn)物的SDS-PAGE分析Fig.2-3 Analysis of SDS-PAGE form the recombinant bacteriaM:蛋白質(zhì)分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)；1:誘導(dǎo)后重組菌表達(dá)產(chǎn)物;2:超聲波破解后上清3:超聲波破解后沉淀M:Protein molecular weight Marker;1:Recombinant bacteria without induction;2:Supernatant afterultrasonic disruption;3.Pellets after ultrasonic disruption;圖2-4 重組菌3A表達(dá)產(chǎn)物的Westernblotting分析Fig.2-4 Analysis of Westernblotting form the recombinant bacteriaM:蛋白質(zhì)分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)；1:超聲波破解后沉淀;2:超聲波破解后上清3:誘導(dǎo)后重組菌表達(dá)產(chǎn)物M:Protein molecular weight Marker;1:;2:Pellets after ultrasonic disruptionSupernatant afterultrasonic disruption;3.Recombinant bacteria without induction1 2 3 M55KD40KD55KD40KD

【參考文獻(xiàn)】

相關(guān)期刊論文 前1條

1 李昊;李義;高建梅;;免疫共沉淀技術(shù)的研究進(jìn)展[J];內(nèi)蒙古醫(yī)學(xué)雜志;2008年04期

本文編號：2786340