【摘要】：骨骼肌衛(wèi)星細(xì)胞是一類位于肌纖維膜表面與基底膜之間的細(xì)胞,在肌肉的發(fā)育和再生過程中發(fā)揮著重要的作用。長非編碼RNA(Long non coding RNAs,lncRNA)是一類轉(zhuǎn)錄本長度超過200nt,具有低蛋白編碼潛力的RNA分子。lncRNA能夠調(diào)控基因表達(dá)、參與表觀遺傳修飾,影響細(xì)胞增殖、分化和凋亡等多種生命活動(dòng)的進(jìn)程。本研究以體外分離的豬骨骼肌衛(wèi)星細(xì)胞為材料,研究一個(gè)新的lncRNAAK394747在細(xì)胞增殖和分化過程發(fā)揮的功能及可能存在的機(jī)制。主要研究結(jié)果如下:1.利用兩步酶消化法成功分離出活性較高、有一定增殖能力的豬原代骨骼肌衛(wèi)星細(xì)胞,經(jīng)差速貼壁純化后,用Pax7基因?qū)Ψ蛛x的細(xì)胞進(jìn)行鑒定,免疫熒光結(jié)果顯示細(xì)胞陽性率高達(dá)95%。同時(shí),對分離的細(xì)胞進(jìn)行分化誘導(dǎo)培養(yǎng),能形成肌管,且穩(wěn)定表達(dá)MyoD、MyoG和MyHc這三個(gè)成肌標(biāo)志基因。2.通過RACE和測序驗(yàn)證了豬AK394747全長為1586bp,生物信息學(xué)分析發(fā)現(xiàn)該lncRNA不具有編碼蛋白的能力,主要存在于細(xì)胞質(zhì)中,時(shí)空表達(dá)譜分析表明AK394747在腿肌、背肌等肌肉組織中高表達(dá),且隨著豬骨骼肌細(xì)胞的分化表達(dá)量上升。3.在豬骨骼肌細(xì)胞中利用干擾和超表達(dá)實(shí)驗(yàn)研究了AK394747對細(xì)胞增殖和分化的影響,EdU、RTCA以及細(xì)胞周期檢測等實(shí)驗(yàn)結(jié)果發(fā)現(xiàn)該lncRNA對骨骼肌細(xì)胞的增殖過程無顯著影響,并且增殖相關(guān)基因ki67、N-Ras和CDK家族基因表達(dá)變化不顯著;而干擾AK394747后,利用Q-PCR、Westren Blotting以及免疫熒光技術(shù)檢測發(fā)現(xiàn)肌細(xì)胞分化標(biāo)志基因MyoD、MyoG、MyHc等的mRNA和蛋白水平表達(dá)顯著下降,表明AK394747促進(jìn)了豬骨骼肌細(xì)胞分化。4.通過生物信息學(xué)篩選了4個(gè)潛在的與AK394747結(jié)合的miRNA—ssc-miR-32,ssc-miR-218,ssc-miR-218-3p,ssc-miR-301。在干擾AK394747后,其中ssc-miR-32及其pri-RNA表達(dá)降低。通過在線軟件預(yù)測發(fā)現(xiàn)AK394747基因與NICD蛋白可能相互結(jié)合,同時(shí)利用Q-PCR技術(shù)檢測發(fā)現(xiàn)干擾AK394747后NICD(Notch1胞內(nèi)片段)基因的表達(dá)顯著升高。本實(shí)驗(yàn)研究了豬lncRNA-AK394747的基本性質(zhì),驗(yàn)證了其促進(jìn)骨骼肌細(xì)胞分化的基因功能,初步預(yù)測了其可能發(fā)揮作用的方式,為研究AK394747在骨骼肌細(xì)胞發(fā)育過程中的作用機(jī)制奠定了基礎(chǔ),同時(shí)也為研究豬骨骼肌生長發(fā)育調(diào)控機(jī)制提供了新的思路。
【學(xué)位授予單位】：華中農(nóng)業(yè)大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2018
【分類號】：S828
【圖文】：

華中農(nóng)業(yè)大學(xué) 2018 屆碩士研究生學(xué)位（畢業(yè)）論文第二章 材料與方法物白豬由華中農(nóng)業(yè)大學(xué)精品豬場提供。體 X Competent 大腸桿菌（DH5α）購自臺灣 YEASTER克隆的載體 pMD18-T Vector 購自 TaKaRa 公司，圖譜

etent 大腸桿菌（DH5α）購自臺灣 體 pMD18-T Vector 購自 TaKaRa 公圖 2-1 pMD18-T 載體Fig.2-1 Circle map of pMD18-TNA3.1 由本實(shí)驗(yàn)室保存，圖譜見下

長非編碼 RNA-AK394747 在豬骨骼肌衛(wèi)星細(xì)胞增殖及分化過程中的作用研究第三章 結(jié)果和分析1 豬骨骼肌細(xì)胞的分離與鑒定1.1 骨骼肌細(xì)胞的純化與培養(yǎng)從第 1 天分離細(xì)胞開始，第 2 天細(xì)胞換液，第 4 天進(jìn)行差速貼壁純化獲得原代豬骨骼肌衛(wèi)星細(xì)胞。此后，每 4 天傳一代。取第三代細(xì)胞接板于 6 孔板，待細(xì)胞長至 80%-90%密度后，更換分化培養(yǎng)基，誘導(dǎo)其分化形成肌管。觀察可發(fā)現(xiàn)，分離的細(xì)胞在分化 3 天開始有肌管形成，在分化 6 天肌管形成明顯增多（圖 3-1），證明分離出的原代細(xì)胞具有分化形成肌管的能力。

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本文編號：2782794