【摘要】：瑞香狼毒是草原毒害草之一,它憑借自身極強的抗逆性在草原上蔓延,破壞了草原的生態(tài)平衡。結(jié)合實驗室前期進行基礎(chǔ)實驗對瑞香狼毒耐鹽性的觀測以及相關(guān)文獻報道,我們選擇依賴其根部高效排鹽機制而擁有耐鹽性的瑞香狼毒作為研究材料。又因為在蒺藜苜蓿和紫花苜蓿中發(fā)現(xiàn)類受體蛋白激酶Srlk蛋白可以感知鹽信號,但是具體將信號傳遞到哪個下游蛋白是不清楚的。結(jié)合類受體蛋白激酶普遍以MAPK家族蛋白作為胞內(nèi)信號傳遞蛋白,其中MPK6蛋白能夠激活SOS1蛋白應(yīng)答鹽脅迫,因此我們在瑞香狼毒根部假定了一條鹽信號傳導(dǎo)途徑,為了驗證這一猜想,我們主要進行了以下研究:(1)結(jié)合已報道的目標(biāo)基因序列與瑞香狼毒轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)庫中本地比對后,確定序列號為c39384.graph_c0、c73211.graph_c1、c59271.graph_c0_seq6的基因為目標(biāo)基因,分別命名為ScMPK6、ScSrlk、ScSOS1,利用Primer 5、Oligo 7軟件設(shè)計引物,然后以瑞香狼毒根部RNA反轉(zhuǎn)錄的cDNA為模板擴增目的基因,借助試劑盒將目的基因成功構(gòu)建到測序載體上進行測序比對。(2)然后對ScMPK6、ScSrlk、ScSOS1基因的生物信息學(xué)進行分析,預(yù)測結(jié)果如下:ScMPK6、ScSrlk、ScSOS1蛋白相對分子質(zhì)量分別為44.2467 k Da、66.83682 k Da、127.13664 k Da,ScMPK6、ScSrlk蛋白具有親水性,ScSOS1蛋白具有疏水性;ScMPK6蛋白沒有跨膜結(jié)構(gòu)域也沒有信號肽,具有TEY基序的活化環(huán)和CD結(jié)構(gòu)域;ScSrlk蛋白序列主要分為胞外結(jié)構(gòu)域、跨膜結(jié)構(gòu)域和胞內(nèi)結(jié)構(gòu)域,胞外包括信號肽和5個亮氨酸重復(fù)序列,含有1個跨膜結(jié)構(gòu)域,胞內(nèi)結(jié)構(gòu)域包括ATP結(jié)合位點和蛋白激酶大家族類似催化域;ScSOS1蛋白N端包括了11個跨膜結(jié)構(gòu)域是Na+/H+交換區(qū)域,C端包括3個保守功能域:環(huán)核苷酸結(jié)合結(jié)構(gòu)域、SOS1蛋白自抑制區(qū)域、SOS2蛋白磷酸化位點;ScSrlk、ScSOS1蛋白錨定于質(zhì)膜上,ScMPK6蛋白游離于細胞核和胞質(zhì)中;ScMPK6蛋白相對保守,ScSOS1蛋白與已知排鹽植物的SOS1蛋白起源一致。(3)利用熒光實時定量PCR對鹽脅迫處理下3個基因非保守序列的表達量進行測定,ScSrlk基因最先響應(yīng)鹽脅迫信號,表達量達到峰值持續(xù)積累一段時間后恢復(fù)至初始表達量以下。ScMPK6基因表達量開始緩慢上升,之后激增到達最大值,又迅速降至最低且不再有上升趨勢。脅迫處理一段時間后ScSOS1基因表達量開始上升,上升至最高值后開始緩慢恢復(fù)至初始水平。(4)在體內(nèi)利用雙分子熒光互補技術(shù)驗證ScMPK6、ScSrlk蛋白之間存在相互作用,作用于細胞周圍;在體外成功誘導(dǎo)表達出特異蛋白,通過蛋白免疫印跡技術(shù)確定為帶標(biāo)簽的目標(biāo)重組融合蛋白ScMPK6::His、GST::ScSrlk。我們推測ScSrlk蛋白作為鹽信號傳感蛋白當(dāng)它感知到外界環(huán)境中的鹽脅迫信號時,將信號傳遞給ScMPK6蛋白后,由它作為胞內(nèi)信號傳遞蛋白激活細胞內(nèi)的鹽脅迫響應(yīng)蛋白ScSOS1來抵御脅迫。我們的驗證結(jié)果與3個蛋白在該模擬信號通路中的職責(zé)一致,這些研究為我們以后深入開展工作提供了很好的借鑒。
【學(xué)位授予單位】：西北大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2018
【分類號】：S812.6
【圖文】：

圖 1.1 植物細胞內(nèi)全部的信號組成[62]Fig. 1.1 A cell with all signaling components in plant[62]1.2 瑞香狼毒瑞香狼毒（Stellera chamaejasme L.）屬于瑞香科狼毒屬多年生草本植物，生于海拔 2600-4200 m 干旱而向陽的高山草坡、草坪或河灘臺地，而且其地理分布范圍極其廣泛[68,69]。瑞香狼毒是草原主要毒害草之一，它的蔓延不僅影響了草原牧草的生長導(dǎo)

樣品質(zhì)量檢測NA 經(jīng)過測定濃度在 800 ng/μl 左右，O（如表 2.1），結(jié)果表明所提取的總 RNA糖凝膠電泳共觀察到 3 個條帶，分別為 28 RNA，且 28S 條帶亮度是 18S 條帶亮度些結(jié)果都顯示所提取的 RNA 可用于下一表 2.1 瑞香狼毒 RNA 分光光度檢測結(jié)果The Nanodrop analysis results of the S.chamaejC（ng/μl） OD260/2801161.22 1.83 659.55 1.78 630.63 1.83

毒 ScMPK6、ScSrlk、ScSOS1 擴增產(chǎn)物瓊e gel electrophoresis of product of ScMPK6S.chamaejasmeer（bp）；1：ScMPK6 PCR 產(chǎn)物（1366 b 產(chǎn)物（3537 bp）ScSrlk、ScSOS1 基因生物信息學(xué)分析ram 分析，推測 ScMPK6 蛋白由 387 18，原子個數(shù)為 6203，相對分子質(zhì)量ropathicity，GRAVY）平均系數(shù)為-0.2式為 C3005H4704N802O871S26，原子個數(shù)為估為-0.027。推測 ScSOS1 蛋白由 111653S38，原子個數(shù)為 18024，相對分子質(zhì)

【參考文獻】

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本文編號：2782758