【摘要】：布魯氏菌(Brucella)可在吞噬細(xì)胞和非吞噬細(xì)胞內(nèi)寄生,引起在我國(guó)流行較為廣泛的傳染性人獸共患布魯氏菌病(Brucellosis)。近年來(lái),隨著畜牧業(yè)的快速發(fā)展,種群數(shù)量和飼養(yǎng)密度逐年增加,導(dǎo)致動(dòng)物間布魯氏菌病的感染率和發(fā)病率驟然上升。該病感染初期不易被察覺(jué),一旦進(jìn)入慢性期可導(dǎo)致多種器官和系統(tǒng)受損。動(dòng)物布魯氏菌病主要引起公畜睪丸炎、母畜流產(chǎn)、死胎等生殖系統(tǒng)疾病;布魯氏菌病患者發(fā)病主要表現(xiàn)為男性睪丸炎、前列腺炎、女性卵巢炎等。布魯氏菌病的流行嚴(yán)重威脅養(yǎng)殖業(yè)的發(fā)展和人類(lèi)健康,同時(shí)造成巨大的經(jīng)濟(jì)損失。過(guò)氧化物還原酶6(Peroxiredoxin 6,Prdx6)是半胱氨酸依賴(lài)性過(guò)氧化物酶家族的一員,具有三種酶活性,包括過(guò)氧化物酶活性、磷脂酶A2活性以及溶血磷脂膽堿脂酰轉(zhuǎn)移酶活性。本課題組前期研究發(fā)現(xiàn),布魯氏菌感染綿羊后,引起綿羊Prdx6的表達(dá)水平發(fā)生明顯的差異變化。為了深入探討Prdx6與布魯氏菌胞內(nèi)寄生的關(guān)系,本課題組成功表達(dá)羊和小鼠Prdx6重組蛋白,并制備抗Prdx6兔源多抗和鼠源單抗。經(jīng)研究發(fā)現(xiàn),宿主Prdx6對(duì)巨噬細(xì)胞內(nèi)布魯氏菌的寄生起促進(jìn)作用,其表達(dá)量的變化與炎癥反應(yīng)、白細(xì)胞遷移明顯相關(guān)。目前未見(jiàn)在其它細(xì)胞中研究布魯氏菌感染與宿主Prdx6關(guān)系的研究報(bào)道�；诰奘杉�(xì)胞中Prdx6與布魯氏菌寄生的重要聯(lián)系,結(jié)合布魯氏菌感染主要侵襲生殖系統(tǒng),本研究以HPT-8(小鼠胚胎滋養(yǎng)層細(xì)胞)、TM4(小鼠睪丸支持細(xì)胞)和CHO(中國(guó)倉(cāng)鼠卵巢細(xì)胞)等生殖系統(tǒng)相關(guān)細(xì)胞為研究對(duì)象,利用過(guò)表達(dá)、沉默和基因敲除等技術(shù)手段,進(jìn)一步探討宿主Prdx6與生殖系統(tǒng)相關(guān)細(xì)胞中布魯氏菌胞內(nèi)寄生能力的關(guān)系,并分析Prdx6表達(dá)量變化引起布魯氏菌感染生殖系統(tǒng)相關(guān)細(xì)胞內(nèi)細(xì)胞因子差異表達(dá)情況,為進(jìn)一步探討布魯氏菌引發(fā)宿主生殖系統(tǒng)疾病的分子機(jī)制提供科學(xué)依據(jù)。本研究利用豬種布魯氏菌S2菌株感染生殖系統(tǒng)相關(guān)細(xì)胞,通過(guò)Western Blot技術(shù)分析胞內(nèi)Prdx6蛋白表達(dá)的變化情況。結(jié)果顯示:在HPT-8、TM4和CHO三種細(xì)胞中,在12 h-48 h Prdx6的表達(dá)量均呈顯著上升趨勢(shì)。表明布魯氏菌感染可以引起生殖系統(tǒng)相關(guān)細(xì)胞Prdx6的差異表達(dá)。通過(guò)RNA干擾載體和過(guò)表達(dá)載體調(diào)節(jié)HPT-8、TM4和CHO細(xì)胞中Prdx6表達(dá)水平,分析Prdx6的差異表達(dá)對(duì)布魯氏菌在生殖系統(tǒng)相關(guān)細(xì)胞內(nèi)存活的影響。同時(shí),利用CRISPR/Cas9技術(shù)敲除HPT-8、TM4和CHO細(xì)胞系Prdx6基因,以非脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染法將構(gòu)建的Prdx6-pSpCas9(BB)-2A-Puro-sgRNA載體轉(zhuǎn)入細(xì)胞,經(jīng)篩選驗(yàn)證,成功建立Prdx6基因缺失的HPT-8細(xì)胞系,并利用豬種布魯氏菌S2菌株侵染Prdx6基因缺失的HPT-8細(xì)胞。結(jié)果顯示,Prdx6的過(guò)表達(dá)可以提高布魯氏菌在HPT-8、TM4和CHO等生殖系統(tǒng)相關(guān)細(xì)胞內(nèi)的寄生能力。Prdx6的敲降和缺失可減弱布魯氏菌胞內(nèi)的生存能力。在對(duì)HPT-8、TM4和CHO中的Prdx6進(jìn)行過(guò)表達(dá)和干擾后,進(jìn)行細(xì)菌侵染實(shí)驗(yàn),利用熒光定量PCR技術(shù)檢測(cè)相關(guān)細(xì)胞因子DLL4、ICAM-1、JAM-A、MCSF、MIP-1b和Progranulin的表達(dá)。結(jié)果顯示:在布魯氏菌侵染條件下,當(dāng)Prdx6上調(diào)表達(dá)時(shí),Progranulin呈現(xiàn)下調(diào)表達(dá)趨勢(shì),MCSF呈現(xiàn)上調(diào)表達(dá)趨勢(shì);在Prdx6敲降組細(xì)胞中則相反。而DLL4、ICAM-1、JAM-A和MIP-1b無(wú)明顯差異。Progranulin和MCSF可能與宿主Prdx6響應(yīng)布魯氏菌感染相關(guān),但仍需進(jìn)一步研究。本研究發(fā)現(xiàn)宿主Prdx6的表達(dá)有利于生殖系統(tǒng)相關(guān)細(xì)胞內(nèi)布魯氏菌的寄生。且在布魯氏菌感染下,Prdx6的差異表達(dá)會(huì)引起Progranulin和MCSF細(xì)胞因子表達(dá)的變化,為深入探究布魯氏菌在生殖系統(tǒng)相關(guān)細(xì)胞中感染與寄生機(jī)制提供新的切入點(diǎn),為布魯氏菌病防控治療的進(jìn)一步研究提供依據(jù)。
【學(xué)位授予單位】：吉林大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2019
【分類(lèi)號(hào)】：S852.61
【圖文】：

第一篇 文獻(xiàn)綜述 第一章 布魯氏菌的研究進(jìn)展質(zhì)網(wǎng)（Endoplasmic Reticulum，ER）運(yùn)輸，為布魯氏菌在 E前提條件。在 T4SS 系統(tǒng)作用下布氏小體持續(xù)與 ER 相互作ar1 和 Rab2 的參與下[40]，布氏小體與過(guò)渡性 ER 之間相互融 LAMP-1 逐漸消失，通過(guò)膜交換獲得 ER 特異性分子如鈣連、sec61β、PDI 等，布氏小體將布魯氏菌送達(dá) ER，并最終轉(zhuǎn)布氏小體（rBCV）。ER 跨膜蛋白 IRE1a 參與布魯氏菌的復(fù)制誘導(dǎo)細(xì)胞自噬的發(fā)生[41]。當(dāng)布魯氏菌到達(dá)復(fù)制位點(diǎn)后，就開(kāi)營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)進(jìn)行復(fù)制，直至細(xì)菌量達(dá)到一定程度終止復(fù)制。當(dāng)數(shù)量后發(fā)生自噬，這種自噬對(duì)布魯氏菌的胞內(nèi)擴(kuò)散至關(guān)重要

圖 2 自噬途徑及其在細(xì)胞存活和細(xì)胞死亡中的作用2 The autophagy pathway and its roles in cell survival and cel道顯示布魯氏菌在宿主細(xì)胞中的存活機(jī)制與細(xì)胞自噬有主的免疫機(jī)制，且非專(zhuān)業(yè)吞噬細(xì)胞殺滅外來(lái)病原菌進(jìn)行手段也是自噬[48]。布魯氏菌 VirB 編碼的調(diào)控蛋白可以應(yīng)分子的分泌，發(fā)現(xiàn) VirB 缺失株侵染細(xì)胞時(shí)，宿主的自細(xì)菌的繁殖力也下降[49]。明布魯氏菌所誘導(dǎo)的自噬與經(jīng)典的自噬過(guò)程不同，它不參與，例如 Atg5、Atg16L、Atg4B、Atg7 等，并且發(fā)現(xiàn)需要 ULK、Beclin 等蛋白的激活[33]。目前布魯氏菌與自清楚。氏菌感染非生殖系統(tǒng)相關(guān)細(xì)胞的研究

圖 3 Prdx6 過(guò)氧化物酶活性的機(jī)制Fig.3 Mechanism for Prdx6 peroxidase activityx6 磷脂酶 A2 活性氧化物酶活性外，哺乳動(dòng)物 Prdx6 還顯示出 Ca2+非依賴(lài)性磷活性[151]。在酸性條件下（pH=4），重組 Prdx6 以及從肺中 PLA2 活性最大[152]。研究表明，向反應(yīng)杯中添加細(xì)胞質(zhì)因子 PLA2 酶活性的 pH 范圍[4]。它能夠水解甘油磷脂的 sn-2 酰基和溶血磷脂膽堿（LPC），并參與過(guò)氧化細(xì)胞膜的修復(fù)[153性參與肺表面活性劑磷脂的轉(zhuǎn)換，其在磷脂重塑中可以產(chǎn)生二DPPC）[154]。化物酶和 PLA2 活性的活性位點(diǎn)在空間上和功能上都是獨(dú)立基于絲氨酸的脂肪酶的 PLA2 活性催化三聯(lián)體結(jié)構(gòu)是 Ser-H

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本文編號(hào)：2781954