【摘要】：三甲基甘氨酸可以促進(jìn)脂肪分解酶表達(dá)以及抑制脂肪合成相關(guān)酶表達(dá),從而降低豬背膘厚,減少皮下脂肪；同時(shí),三甲基甘氨酸可緩解高脂引起的肝臟脂肪變性以及脂肪組織功能紊亂。目前,關(guān)于三甲基甘氨酸作用機(jī)制的研究發(fā)現(xiàn),三甲基甘氨酸調(diào)節(jié)脂肪沉積與AMPK關(guān)系密切。但是三甲基甘氨酸是否通過(guò)激活A(yù)MPK,進(jìn)一步影響其下游信號(hào)通路,從而發(fā)揮降低機(jī)體脂肪沉積的作用還有待深入研究。因此,本試驗(yàn)以AMPKα1敲除小鼠為模型,利用高脂飼料誘導(dǎo)肥胖,首先在體內(nèi)試驗(yàn)中,研究了三甲基甘氨酸對(duì)高脂誘導(dǎo)的野生型和AMPKα1敲除小鼠體增重、血液指標(biāo)、肝臟和脂肪組織脂肪沉積的影響；在此基礎(chǔ)上,利用knockdown AMPKα1、激活或抑制AMPK活性以及利用甲基化抑制劑等方法,在體外細(xì)胞試驗(yàn)中,深入探討了三甲基甘氨酸通過(guò)激活A(yù)MPK通路來(lái)緩解動(dòng)物機(jī)體脂肪沉積的可能機(jī)制。主要研究結(jié)果如下：試驗(yàn)一：三甲基甘氨酸對(duì)高脂誘導(dǎo)的小鼠體增重和血液指標(biāo)的影響本試驗(yàn)構(gòu)建了AMPKα1敲除小鼠模型,并對(duì)比研究了三甲基甘氨酸對(duì)高脂誘導(dǎo)的野生型和AMPKα1敲除小鼠體增重、血脂水平和與脂肪代謝相關(guān)激素水平的影響。體增重：野生型和AMPKα1敲除小鼠的體增重?zé)o顯著差異(P0.05)；在野生型小鼠中,高脂誘導(dǎo)顯著提高了體增重(P0.05),而高脂組加入三甲基甘氨酸則緩解了高脂誘導(dǎo)的體增重增加(P0.05)；在AMPKα1敲除小鼠中,高脂誘導(dǎo)也顯著提高了體增重(P0.05),但高脂組加入三甲基甘氨酸對(duì)高脂誘導(dǎo)的體增重增加無(wú)緩解作用；血液甘油三酯和游離脂肪酸：野生型和AMPKα1敲除小鼠血液中甘油三酯(TG)和游離脂肪酸(FFA)水平無(wú)顯著差異(P0.05)；在野生型小鼠中,高脂誘導(dǎo)顯著提高了血液中TG和FFA水平(P0.05),而高脂組加入三甲基甘氨酸則緩解了高脂誘導(dǎo)的TG和FFA水平升高(P0.05)；在AMPKα1敲除小鼠中,高脂誘導(dǎo)也顯著提高了血液中TG和FFA水平(P0.05),但高脂組加入三甲基甘氨酸對(duì)高脂引起的TG和FFA水平變化無(wú)緩解作用。脂肪代謝相關(guān)激素水平：野生型和AMPKα1敲除小鼠血液中胰島素和瘦素水平無(wú)顯著差異(P0.05)；在野生型小鼠中,高脂誘導(dǎo)顯著提高了血液中胰島素和瘦素水平(P0.05),但高脂組加入三甲基甘氨酸則顯著緩解了高脂誘導(dǎo)的胰島素和瘦素水平升高(P0.05)；在AMPKα1敲除小鼠中,高脂誘導(dǎo)也顯著提高了血液中胰島素和瘦素水平(P0.05),但高脂組加入三甲基甘氨酸對(duì)高脂誘導(dǎo)的激素水平變化無(wú)緩解作用。以上結(jié)果提示三甲基甘氨酸可降低小鼠體增重、降低血脂和激素水平,且AMPKα1在三甲基甘氨酸發(fā)揮這些作用過(guò)程中起關(guān)鍵作用。試驗(yàn)二：三甲基甘氨酸對(duì)高脂誘導(dǎo)小鼠機(jī)體脂肪沉積的影響及初步機(jī)制研究在上述體重和血液指標(biāo)研究的基礎(chǔ)上,進(jìn)一步研究了三甲基甘氨酸對(duì)高脂誘導(dǎo)的野生型和AMPKα1敲除小鼠脂肪沉積的影響,結(jié)果如下：在肝臟組織脂肪沉積方面：組織切片油紅O染色顯示：野生型和AMPKα1敲除小鼠肝臟脂肪沉積無(wú)差異；在野生型小鼠中,高脂誘導(dǎo)提高了肝臟脂肪沉積,而高脂組加入三甲基甘氨酸則緩解了高脂誘導(dǎo)的肝臟脂肪沉積；在AMPKα1敲除小鼠中,高脂誘導(dǎo)也提高了肝臟脂肪沉積,但高脂組加入三甲基甘氨酸對(duì)高脂誘導(dǎo)的肝臟脂肪沉積無(wú)降低作用。線粒體功能和脂肪酸氧化：野生型和AMPKα1敲除小鼠肝臟線粒體功能(PGC1α)和脂肪酸氧化(CPT1a)相關(guān)蛋白表達(dá)無(wú)顯著差異(P0.05)；在野生型小鼠中,高脂誘導(dǎo)顯著降低了肝臟PGC1α和CPT1a蛋白表達(dá)(P0.05),而高脂組加入三甲基甘氨酸則顯著提高了PGC1α和CPT1a蛋白表達(dá)(P0.05)；在AMPKα1敲除小鼠中,高脂誘導(dǎo)也顯著降低了肝臟PGC1α和CPT1a蛋白表達(dá)(P0.05),但高脂組加入三甲基甘氨酸提高了PGC1α和CPT1a蛋白表達(dá)(P0.05)。本試驗(yàn)室前期研究發(fā)現(xiàn)m6A甲基化水平與脂肪沉積成正相關(guān),而三甲基甘氨酸是重要的甲基供體,因此我們進(jìn)一步檢測(cè)了肝臟中m6A甲基化水平以及去甲基化酶FTO蛋白表達(dá)：野生型和AMPKα1敲除小鼠肝臟FTO蛋白表達(dá)和m6A甲基化水平無(wú)顯著差異(P0.05)；在野生型小鼠中,高脂誘導(dǎo)顯著提高了肝臟FTO蛋白表達(dá)(P0.05),降低了m6A甲基化水平(P0.05),而高脂組加入三甲基甘氨酸顯著緩解了高脂誘導(dǎo)的FTO蛋白表達(dá)和m6A甲基化的變化(P0.05)；在AMPKα1敲除小鼠中,高脂誘導(dǎo)也顯著提高了肝臟FTO蛋白表達(dá)(P0.05),降低了m6A甲基化水平(P0.05),但高脂組加入三甲基甘氨酸顯著緩解了高脂引起的m6A甲基化和FTO蛋白表達(dá)的變化(P0.05)。在附睪脂肪組織脂肪沉積方面：附睪脂肪組織含量：野生型和AMPKα1敲除小鼠附睪脂肪組織含量無(wú)顯著差異(P0.05)；在野生型小鼠中,高脂誘導(dǎo)顯著提高附睪脂肪組織含量(P0.05),而高脂組加入三甲基甘氨酸則顯著緩解了高脂誘導(dǎo)的附睪脂肪組織含量的增加(P0.05)；在AMPKα1敲除小鼠中,高脂誘導(dǎo)也顯著提高了附睪脂肪組織含量(P0.05),但高脂組加入三甲基甘氨酸則對(duì)高脂誘導(dǎo)的附睪脂肪組織含量的增加無(wú)緩解作用。線粒體功能和脂肪酸氧化：野生型和AMPKα1敲除小鼠附睪脂肪組織PGC1α和CPT1a蛋白表達(dá)無(wú)顯著差異(P0.05)；在野生型小鼠中,高脂誘導(dǎo)顯著降低了附睪脂肪組織PGC1α和CPT1a蛋白表達(dá)(P0.05),而高脂組加入三甲基甘氨酸則顯著提高了PGC1α和CPT1a蛋白表達(dá)(P0.05)；在AMPKα1敲除小鼠中,高脂誘導(dǎo)也顯著降低了PGC1α和CPT1α蛋白表達(dá)(P0.05),但高脂組加入三甲基甘氨酸對(duì)PGC1α和CPT1a蛋白表達(dá)無(wú)顯著影響。FTO蛋白表達(dá)和m6A甲基化：野生型和AMPKα1敲除小鼠附睪脂肪組織FTO蛋白表達(dá)和m6A甲基化水平無(wú)顯著差異(P0.05)；在野生型小鼠中,高脂誘導(dǎo)顯著提高了FTO蛋白表達(dá)(P0.05),降低m6A甲基化水平(P0.05),而高脂組加入三甲基甘氨酸則顯著緩解了高脂引起的FTO蛋白表達(dá)和m6A甲基化水平的變化(P0.05)；在AMPKα1敲除小鼠中,高脂誘導(dǎo)也顯著提高FTO蛋白表達(dá)(P0.05),降低m6A甲基化水平(P0.05),但高脂組加入三甲基甘氨酸對(duì)高脂引起的m6A甲基化和FTO蛋白表達(dá)無(wú)顯著影響。以上結(jié)果提示三甲基甘氨酸顯著降低肝臟和附睪脂肪組織的脂肪沉積,顯著提高肝臟和附睪脂肪組織線粒體功能、脂肪酸氧化和m6A甲基化水平,且AMPKα1在三甲基甘氨酸發(fā)揮這些作用過(guò)程中起關(guān)鍵作用。試驗(yàn)三：三甲基甘氨酸降低脂肪細(xì)胞脂肪沉積的AMPK機(jī)制研究在上述體內(nèi)試驗(yàn)初步證明了AMPKα1在三甲基甘氨酸降低脂肪沉積的作用中起關(guān)鍵作用,在此基礎(chǔ)上,本試驗(yàn)利用分離得到的小鼠附睪脂肪細(xì)胞,進(jìn)一步通過(guò)體外試驗(yàn)驗(yàn)證三甲基甘氨酸通過(guò)激活A(yù)MPK通路來(lái)降低脂肪組織脂肪沉積的可能機(jī)制。在脂肪細(xì)胞中knockdown AMPKα1:三甲基甘氨酸可以顯著降低脂肪細(xì)胞的脂肪沉積,提高脂肪細(xì)胞CPT1α釉PGC1α蛋白表達(dá)和m6A甲基化水平(P0.05)；但knockdown AMPKα1后,三甲基甘氨酸對(duì)脂肪細(xì)胞的脂肪沉積,CPT1a, PGC1α和FTO蛋白表達(dá)以及m6A甲基化水平均無(wú)顯著影響(P0.05)。在脂肪細(xì)胞中激活或抑制AMPK活性：為進(jìn)一步探究AMPK和m6A甲基化的關(guān)系,在脂肪細(xì)胞中激活A(yù)MPK顯著降低了FTO蛋白表達(dá)水平(P0.05),顯著提高了脂肪細(xì)胞m6A甲基化水平(P0.05)；但抑制AMPK對(duì)m6A甲基化和FTO蛋白表達(dá)水平無(wú)顯著影響(P0.05)。在脂肪細(xì)胞中抑制甲基化反應(yīng)：為進(jìn)一步了解甲基化反應(yīng)是否是三甲基甘氨酸發(fā)揮作用的重要途徑之一,利用Neplanocin A (NPA)處理脂肪細(xì)胞發(fā)現(xiàn)抑制甲基化反應(yīng)后,脂肪細(xì)胞mRNA m6A甲基化水平顯著降低(P0.05)；三甲基甘氨酸顯著降低了脂肪細(xì)胞脂肪沉積(P0.05),但抑制甲基化反應(yīng)后,三甲基甘氨酸對(duì)脂肪細(xì)胞脂肪沉積無(wú)顯著影響(P0.05)。以上結(jié)果提示三甲基甘氨酸可能是通過(guò)激活A(yù)MPK活性,降低FTO表達(dá),提高m6A甲基化水平來(lái)降低脂肪細(xì)胞脂肪沉積,AMPKα1在其中起關(guān)鍵作用。綜上所述,三甲基甘氨酸可以激活A(yù)MPKα1,進(jìn)一步提高脂肪酸氧化,線粒體功能以及m6A甲基化水平,從而發(fā)揮降低體脂沉積的作用。
【學(xué)位授予單位】：浙江大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類(lèi)號(hào)】：S816

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本文編號(hào)：2779784